Окрашивание аппарата Гольджи церамидами, меченными BDP красителями

Церамиды являются предшественниками сфинголипидов, состоящими из сфингозина и жирной кислоты, соединенных между собой амидной связью. BDP церамиды представляют собой синтетические флуоресцентные липиды, конъюгаты флуоресцентных красителей BDP со сфингозином. Внутри клетки BDP церамиды включаются в мембраны аппарата Гольджи, поэтому данные красители широко используются в клеточной биологии для визуализации аппарата Гольджи в живых и фиксированных клетках методами флуоресцентной микроскопии.

Приготовление растворов

1.1 Стоковые растворы

BDP FL церамид:

Растворите 50 мкг BDP FL церамида в 87,2 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.
Растворите 250 мкг BDP FL церамида в 436 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.

BDP TMR церамид:

Растворите 50 мкг BDP TMR церамида в 73,6 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.
Растворите 250 мкг BDP TMR церамида в 368 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.

BDP TR церамид:

Растворите 50 мкг BDP TR церамида в 70,8 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.
Растворите 250 мкг BDP TR церамида в 354 мкл ДМСО для получения 1 мМ стокового раствора.

Стоковые растворы можно хранить при −20°C или −80°C в защищенном от света месте. Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.

1.2 Окрашивающий раствор

Отмерьте 10 мл забуференного солевого раствора Хэнкса, содержащего 10 мМ HEPES (HBSS/HEPES), pH 7,4, в пластиковую пробирку емкостью 50 мл. Также подходят другие бессывороточные солевые растворы, например, PBS.

(Опционально). Для предотвращения округления живых клеток и отделения их от стекла в буферный раствор можно добавить 1 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺.

Добавьте 3,4 мг (0,34 мг/мл) обезжиренного БСА в пробирку с буфером.
Добавьте 200 мкл 1 мМ стокового раствора церамида, чтобы получить рабочий раствор, содержащий 5 мкМ церамида / 5 мкМ БСА. Точная концентрация церамида зависит от типа и плотности клеток и должна определяться экспериментально.

Полученный раствор комплекса церамид/БСА можно хранить в пластиковых флаконах при −20°C.

Окрашивание клеток

2.1 Живые клетки

Вырастите клетки на стерильном покровном стекле. Адгезивную культуру клеток можно окрашивать непосредственно на покровном стекле.
Аспирируйте среду из лунки с покровным стеклом.
Промойте клетки подходящей культуральной средой (например, HBSS/HEPES).
Инкубируйте клетки с 5 мкМ раствором церамида/БСА в течение 30 мин при 4°C.
Отмойте клетки несколько раз холодной культуральной средой.
Промойте клетки в растворе обезжиренного БСА (0,34 мг/мл) в HBSS/HEPES четыре раза по 30 мин при комнатной температуре.
Инкубируйте клетки в свежей среде при 37°C дополнительные 30 мин.
Промойте клетки свежей культуральной средой.
(Опционально) Окрашенные клетки можно фиксировать 4% формальдегидом в течение 2 мин при 4°C. Отмойте фиксированные клетки дважды PBS.
Для флуоресцентной микроскопии переверните покровное стекло с окрашенными клетками на предметное стекло, поместив таким образом клетки между стеклами.

2.2 Фиксированные клетки

Фиксируйте клетки 4% формальдегидом в течение 5 мин при 4°C.
Промойте фиксированные клетки PBS дважды по 5 мин.
Инкубируйте клетки с 5 мкМ комплексом церамид/БСА в PBS в течение 30 мин при 4°C.
Промойте клетки в растворе обезжиренного БСА (0,34 мг/мл) в PBS четыре раза по 30 мин при комнатной температуре.
Промойте клетки PBS два раза при комнатной температуре.
Для флуоресцентной микроскопии поместите клетки под покровное стекло, используя монтировочную среду.