Определение концентрации двухцепочечной ДНК с помощью красителя Pico488

Краситель Pico488 для определения концентрации ДНК представляет собой высокочувствительный реагент для определения малых концентраций двухцепочечной ДНК (не определяемых спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм). Благодаря селективному связыванию красителя с двухцепочечной ДНК на результаты измерения не оказывают влияния одноцепочечная ДНК, РНК, нуклеотиды, белки и другие присутствующие в пробе примеси. Структура красителя Pico488 идентична структуре красителя PicoGreen®.

Линейный диапазон измерения концентрации ДНК с помощью красителя Pico488 составляет 1 пг/мкл - 5 нг/мкл. Краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм (для проведения измерений подойдет любой тип флуориметра). Для большей точности и воспроизводимости данных рекомендуется разводить образцы ДНК и краситель Pico488 в TE буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ EDTA). Для расчёта концентрации исследуемой ДНК необходимо построить калибровочную кривую, используя серию разведений стандартного раствора ДНК.

Буфер, стандартный раствор ДНК и краситель Pico488 входят в состав набора Pico488. Краситель Pico488 также доступен для заказа отдельно. Раствора красителя объемом 1 мл достаточно для проведения 200 измерений для образца объемом 2 мл (минимально необходимый объём образца для измерений в стандартной флуориметрической кювете объёмом 3.5 мл). Количество измерений может варьировать в зависимости от объема образца. Рекомендуемые объёмы образца для наиболее популярного флуориметрического оборудования представлены ниже в таблице.

Протокол

1. Приготовление рабочего раствора Pico488.

Разморозьте и тщательно перемешайте содержимое пробирки с красителем. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора красителя для всех образцов (исследуемые образцы и стандартные растворы ДНК): объём рабочего раствора красителя должен составить 50% от общего объёма измеряемого образца (уточните в таблице ниже рекомендуемый объём образца для используемого оборудования). Разведите необходимое количество красителя Pico488 в 200 раз буфером (мы рекомендуем использовать TE буфер: 10 мМ Тris HCl, 1 мМ EDTA, pH 7.5). Перемешайте. Раствор пригоден для использования в течение 3 часов.

! Чтобы нивелировать возможные ошибки дозирования, мы рекомендуем приготовить рабочий раствор красителя с запасом 10-25%. Для расчета необходимого объёма рабочего раствора красителя Вы можете воспользоваться следующей формулой:

VPico488 = 5/8 × Vобразца × (Nобразцов+ Nстандартов), где Vобразца – измеряемый объем исследуемого образца или стандарта, Nобразцов – количество измеряемых образцов, и Nстандартов – количество измеряемых стандартов (включая образец с нулевой концентрацией ДНК).

2. Приготовление образцов

Разведите исследуемый образец ДНК в буфере таким образом, чтобы объём образца составил 50% измеряемого объема (исходный объём образца может быть любым, однако конечное разведение должно соответствовать диапазону 1 пг/мкл - 5 нг/мкл). Добавьте равный объем рабочего раствора красителя Pico488. Перемешайте и инкубируйте 5 минут.

Аналогичным образом приготовьте разведения стандартного раствора ДНК. Обратите внимание, что разведения стандартного раствора ДНК должны находиться в диапазоне концентраций экспериментальных образцов и быть приготовлены таким образом, чтобы соответствовать линейному диапазону измерений вашего оборудования. Готовый стандартный раствор ДНК доступен только в составе набора Pico488. При заказе красителя Pico488 отдельно (не в составе набора), поставка стандартного раствора ДНК не предусмотрена.

Рекомендуемые объёмы для измерения концентрации ДНК с помощью красителя Pico488:

Тип оборудования Общий объём образца Объём рабочего раствора красителя Pico488 Объём экспериментального образца ДНК
Стандартная флуориметрическая кювета (3.5 мл) 2 мл 1 мл 1 мл
Другие флуориметрические кюветы около 75% объёма кюветы 37.5% объёма кюветы 37.5% объёма кюветы
96-луночный планшет*, на лунку 0.2 мл 0.1 мл 0.1 мл
24-луночный планшет, на лунку 1 мл 0.5 мл 0.5 мл
Другие планшеты около 75% объёма лунки 37.5% объёма лунки 37.5% объёма лунки
NanoDrop™ 3300* 0.1 мл 0.05 мл 0.05 мл

* Для обеспечения точности измерений рекомендуется избегать дозирования объёмов менее 2 мкл.

3. Измерение флуоресценции

Измерьте интенсивность флуоресценции стандартных растворов ДНК и экспериментальных образцов ДНК (краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм).

4. Расчет концентрации ДНК

Постройте калибровочную кривую, используя данные об уровне флуоресценции стандартных растворов. Аппроксимируйте данные линейной функцией, найдите параметры функции A и B. Линейное уравнение зависимости флуоресценции (FL) от концентрации (C) выглядит следующим образом:

FL= A × C + B , где FL – интенсивность флуоресценции в усл. ед., а C – концентрация ДНК, нг/мл, A и B – параметры линейной функции.

Концентрация ДНК в экспериментальном образце:

Csample= (FLsample– B)/A, где FLsample – флуоресценция образца, A и B – параметры найденной линейной функции.

Концентрация ДНК в исходном образце:

Сinit = Vassay × Csample/Vinit, где Vassay – объём образца, мкл и Vinit – объем исходного образца ДНК, использованный для приготовления экспериментального образца, мкл

Для проведения необходимых вычислений Вы также можете воспользоваться нашими калькуляторами: для расчета концентрации ДНК и приготовления/разбавления растворов.

Пример уравнения зависимости флуоресценции от концентрации ДНК:

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.