Мечение олигонуклеотидов и ДНК методом клик-химии

Клик-химия — это совокупность разнообразных реакций, которые могут быть использованы для синтеза различных конъюгатов. Практически любую биомолекулу можно легко пометить путем конъюгации с небольшими молекулами, такими как флуоресцентные красители, биотин и др., методом клик-химии. Реакция клик-химии происходит между двумя компонентами: азидом и алкином (терминальным ацетиленом). Поскольку азидная и алкиновая группы практически не встречаются в природных биомолекулах, реакции между ними отличаются высокой биоортогональностью и специфичностью. При необходимости пометить олигонуклеотид, можно заказать его алкин-модифицированную форму.

Протокол

Для мечения алкин-модифицированных олигонуклеотидов с помощью азидов производства компании Lumiprobe, мы рекомендуем использовать следующий протокол. Вспомогательные реагенты можно также заказать в компании Lumiprobe.

  1. Рассчитайте объемы реагентов, необходимых для мечения методом клик-химии, согласно таблице, приведенной ниже. Подготовьте необходимые исходные растворы (см. Приложение).
    Реагент Конечная концентрация в смеси Концентрация исходного раствора
    Олигонуклеотид, алкин-модифицированный Варьирует (20–200 мкM) Варьирует
    Азид В 1,5 раза больше конечной концентрации олигонуклеотида 10 мМ в ДМСО
    ДМСО 50 об. % —
    Аскорбиновая кислота 0,5 мМ 5 мМ в воде
    Медь(II)-TBTA 0,5 мМ 10 мМ в 55 об. % ДМСО
  2. Растворите алкин-модифицированный олигонуклеотид или ДНК в воде в герметичной пробирке.
  3. Добавьте 2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0) до конечной концентрации 0,2 М.
  4. Добавьте ДМСО и перемешайте на вортексе.
  5. Добавьте исходный раствор азида (10 мМ в ДМСО) и перемешайте на вортексе.
  6. Добавьте к смеси требуемый объем 5 мМ исходного раствора аскорбиновой кислоты и кратко перемешайте на вортексе.
  7. Дегазируйте раствор барботированием инертного газа в течение 30 с. Можно использовать азот, аргон или гелий.
  8. Добавьте к смеси необходимое количество 10 мМ исходного раствора меди(II)-ТБТА в 55 об. % ДМСО. Продуйте пробирку инертным газом и закройте крышку.
  9. Тщательно перемешайте смесь на вортексе. Если наблюдается значительное выпадение в осадок азида, нагрейте пробирку в течение 3 мин при 80°C и перемешайте смесь на вортексе.
  10. Оставить на ночь при комнатной температуре.
  11. Осадите конъюгат ацетоном (для олигонуклеотидов) или этанолом (для ДНК).

    Для осаждения конъюгата олигонуклеотида:

    добавьте к смеси минимум 4-кратный объем 3% раствора перхлората лития в ацетоне (если объем смеси большой, разделите её на несколько пробирок).

    Для осаждения конъюгата ДНК:

    добавьте ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М к смеси;

    добавьте 2,5 объема этанола (или 0,8 объема изопропанола).

    Тщательно перемешайте и выдержите в течение 20 мин при −20°C.

  12. Центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
  13. Удалите супернатант.
  14. Промойте осадок ацетоном (1 мл), центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
  15. Удалите супернатант, высушите осадок и очистите конъюгат с помощью ОФ ВЭЖХ или ПААГ.

Приложение. Приготовление исходных растворов реагентов для мечения методом клик-химии.

5 мМ исходный раствор аскорбиновой кислоты

Приготовление Растворите 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл дистиллированной воды.
Хранение Аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Раствор стабилен в течение суток. Для клик-химии используйте свежий раствор.

10 мМ исходный раствор меди(II)-TБTA в 55 об. % ДМСО

Приготовление Растворите 50 мг сульфата меди(II) пятиводного в 10 мл дистиллированной воды. Растворите 116 мг ТБТА (лиганда) в 11 мл ДМСО. Смешайте два раствора.
Хранение Храните при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0)

Приготовление Смешайте 2,78 мл триэтиламина с 1,14 мл уксусной кислоты. Добавьте воду до общего объема 10 мл, доведите pH до 7,0.
Хранение Хранить при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

Похожие товары

Cu(II)-TBTA комплекс

Катализатор для клик-реакции. Стабильный комплекс меди (II), который должен быть переведен в одновалентную медь (I) с помощью восстановителей. Комплекс может быть использован для приготовления реакционного буфера любого состава.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
21050 1.5 mL $75 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.