Протокол: Мечение олигонуклеотидов и ДНК методом клик-химии

Клик-химия — это совокупность разнообразных реакций, которые могут быть использованы для синтеза различных конъюгатов. Практически любую биомолекулу можно легко пометить путем конъюгации с небольшими молекулами, такими как флуоресцентные красители, биотин и др., методом клик-химии. Реакция клик-химии происходит между двумя компонентами: азидом и алкином (терминальным ацетиленом). Поскольку азидная и алкиновая группы практически не встречаются в природных биомолекулах, реакции между ними отличаются высокой биоортогональностью и специфичностью. При необходимости пометить олигонуклеотид, можно заказать его алкин-модифицированную форму.

Протокол

Для мечения алкин-модифицированных олигонуклеотидов с помощью азидов призводства компании Lumiprobe, мы рекомендуем использовать следующий протокол. Вспомогательные реагенты можно также заказать в компании Lumiprobe.

  1. Рассчитайте объемы реагентов, необходимых для мечения методом клик-химии, согласно таблице, приведенной ниже. Подготовьте необходимые исходные растворы (см. Приложение).
    Реагент Конечная концентрация в смеси Концентрация исходного раствора
    Олигонуклеотид, алкин-модифицированный Варьирует (20–200 мкM) Варьирует
    Азид В 1,5 раза больше конечной концентрации олигонуклеотида 10 мМ в ДМСО
    ДМСО 50 об. %
    Аскорбиновая кислота 0,5 мМ 5 мМ в воде
    Медь(II)-TBTA 0,5 мМ 10 мМ в 55 об. % ДМСО
  2. Растворите алкин-модифицированный олигонуклеотид или ДНК в воде в герметичной пробирке.
  3. Добавьте 2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0) до конечной концентрации 0,2 М.
  4. Добавьте ДМСО и перемешайте на вортексе.
  5. Добавьте исходный раствор азида (10 мМ в ДМСО) и перемешайте на вортексе.
  6. Добавьте к смеси требуемый объем 5 мМ исходного раствора аскорбиновой кислоты и кратко перемешайте на вортексе.
  7. Дегазируйте раствор барботированием инертного газа в течение 30 с. Можно использовать азот, аргон или гелий.
  8. Добавьте к смеси необходимое количество 10 мМ исходного раствора меди(II)-ТБТА в 55 об. % ДМСО. Продуйте пробирку инертным газом и закройте крышку.
  9. Тщательно перемешайте смесь на вортексе. Если наблюдается значительное выпадение в осадок азида, нагрейте пробирку в течение 3 мин при 80 °C и перемешайте смесь на вортексе.
  10. Оставить на ночь при комнатной температуре.
  11. Осадите конъюгат ацетоном (для олигонуклеотидов) или этанолом (для ДНК). Добавьте как минимум 4-кратный объем ацетона к смеси (если объем смеси большой, разделите ее на несколько пробирок). Тщательно перемешайте и выдержите в течение 20 мин при −20 °C.
  12. Центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
  13. Удалите супернатант.
  14. Промойте осадок ацетоном (1 мл), центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
  15. Удалите супернатант, высушите осадок и очистите конъюгат с помощью ОФ ВЭЖХ или ПААГ.

Приложение. Приготовление исходных растворов реагентов для мечения методом клик-химии.

5 мМ исходный раствор аскорбиновой кислоты

Приготовление Растворите 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл дистиллированной воды.
Хранение Аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Раствор стабилен в течение суток. Для клик-химии используйте свежий раствор.

10 мМ исходный раствор меди(II)-TБTA в 55 об. % ДМСО

Приготовление Растворите 50 мг сульфата меди(II) пятиводного в 10 мл дистиллированной воды. Растворите 116 мг ТБТА (лиганда) в 11 мл ДМСО. Смешайте два раствора.
Хранение Храните при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0)

Приготовление Смешайте 2,78 мл триэтиламина с 1,14 мл уксусной кислоты. Добавьте воду до общего объема 10 мл, доведите pH до 7,0.
Хранение Хранить при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

Related products

BDP 558/568 азид

BDP 558/568 - бордипиррометеновый флуорофор со спектрами поглощения и эмиссии, примерно соответствующими каналу Cyanine3. Это азидопроизводное для клик-реакций.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
17430 1 mg $110.00 в наличии
27430 5 mg $210.00 в наличии
37430 10 mg $310.00 в наличии
47430 25 mg $410.00 в наличии
57430 50 mg $695.00 в наличии
67430 100 mg по запросу в наличии

BDP 650/665 алкин

BDP 650/665 - яркий бордипиррометеновый красный краситель. Терминальную этинильную группу BDP 650/665 алкина можно конъюгировать с различными азидами с помощью медь-катализируемой клик-реакции.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A84B0 1 mg $110.00 в наличии
B84B0 5 mg $210.00 в наличии
C84B0 10 mg $310.00 в наличии
D84B0 25 mg $410.00 в наличии
E84B0 50 mg $695.00 в наличии
F84B0 100 mg $1190.00 5 д

BDP R6G алкин

Производное красителя BDP R6G - терминальный алкин для Click chemistry. BDP R6G - бордипиррометеновый краситель, спектры поглощения и эмиссии которого соответствуют R6G (родамину 6G).
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A44B0 1 mg $110.00 в наличии
B44B0 5 mg $210.00 в наличии
C44B0 10 mg $310.00 в наличии
D44B0 25 mg $410.00 в наличии
E44B0 50 mg $695.00 в наличии
F44B0 100 mg $1190.00 в наличии

BDP TMR азид

Бордипиррометеновый краситель с азидогруппой. Спектральные свойства похожи на краситель TAMRA. Благодаря длительному времени жизни возбужденного состояния этот краситель хорошо подходит для измерений поляризации флуоресценции.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
12430 1 mg $110.00 в наличии
22430 5 mg $210.00 в наличии
32430 10 mg $310.00 в наличии
42430 25 mg $410.00 в наличии
52430 50 mg $695.00 в наличии
62430 100 mg $1190.00 в наличии

Cyanine3.5 азид

Азидопроизводное красителя Cyanine3.5, аналога Cy3.5, для мечения с помощью реакции Click Chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
12030 100 uL, 10 mM/DMSO $110.00 в наличии
32030 500 uL, 10 mM/DMSO $210.00 в наличии
42030 1 mL, 10 mM/DMSO $410.00 в наличии
A2030 1 mg $110.00 в наличии
B2030 5 mg $210.00 в наличии
C2030 10 mg $310.00 в наличии
D2030 25 mg $410.00 в наличии
E2030 50 mg $695.00 в наличии
F2030 100 mg $1190.00 в наличии

Cyanine3 азид

Азидопроизводное флуоресцентного красителя Cyanine3, аналога Cy3, для конъюгации с помощью клик-реакций.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
11030 100 uL, 10 mM/DMSO $110.00 в наличии
31030 500 uL, 10 mM/DMSO $210.00 в наличии
41030 1 mL, 10 mM/DMSO $410.00 в наличии
A1030 1 mg $110.00 в наличии
B1030 5 mg $210.00 в наличии
C1030 10 mg $310.00 в наличии
D1030 25 mg $410.00 в наличии
E1030 50 mg $695.00 в наличии
F1030 100 mg $1190.00 в наличии

R110 азид, 5-изомер

Фотостабильный и яркий краситель для канала FAM в виде азидопроизводного для Click Chemistry, чистый 5-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
Фасовок данного продукта нет в наличии, но на данный продукт можно отправить запрос .

R110 азид, 6-изомер

Чистый изомер азидопроизводного R110 (родамина 110) - яркого и фотостабильного красителя для канала FAM.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
15230 100 uL, 10 mM/DMSO $160.00 в наличии
35230 500 uL, 10 mM/DMSO $420.00 в наличии
45230 1 mL, 10 mM/DMSO $595.00 в наличии
A5230 1 mg $110.00 в наличии
D5230 25 mg $410.00 в наличии
E5230 50 mg $695.00 5 д
F5230 100 mg по запросу 10 д

sulfo-Cyanine7.5 азид

Sulfo-Cyanine7.5 - очень гидрофильный и водорастворимый краситель для ближней ИК-области. Спектры поглощения и эмиссии красителя напоминают спектры индоцианинового зеленого (ICG, Cardio Green), но sulfo-Cyanine7.5 обладает гораздо более высоким квантовым выходом флуоресценции. Этот краситель отлично подходит для имэджинга in vivo. Это производное - азид для Click chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A6330 1 mg $110.00 в наличии
B6330 5 mg $290.00 в наличии
C6330 10 mg $470.00 в наличии
D6330 25 mg $690.00 в наличии
E6330 50 mg $1270.00 в наличии
F6330 100 mg $1990.00 в наличии

Пирен азид 1

Азидопроизводное полициклического ароматического углеводорода пирена, обладающего флуоресценцией и способностью к образованию эксимеров.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A1530 1 mg $110.00 в наличии
B1530 5 mg $210.00 в наличии
C1530 10 mg $310.00 в наличии
D1530 25 mg $410.00 в наличии
E1530 50 mg $695.00 в наличии

Пирен азид 3

Азидопроизводное пирена с длинным линкером для клик-химии Pyrene azide with even longer linker for Click Chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
Фасовок данного продукта нет в наличии, но на данный продукт можно отправить запрос .

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.