Мечение олигонуклеотидов и ДНК методом клик-химии

Клик-химия — это совокупность разнообразных реакций, которые могут быть использованы для синтеза различных конъюгатов. Практически любую биомолекулу можно легко пометить путем конъюгации с небольшими молекулами, такими как флуоресцентные красители, биотин и др., методом клик-химии. Реакция клик-химии происходит между двумя компонентами: азидом и алкином (терминальным ацетиленом). Поскольку азидная и алкиновая группы практически не встречаются в природных биомолекулах, реакции между ними отличаются высокой биоортогональностью и специфичностью. При необходимости пометить олигонуклеотид, можно заказать его алкин-модифицированную форму.

Протокол

Для мечения алкин-модифицированных олигонуклеотидов с помощью азидов производства компании Lumiprobe, мы рекомендуем использовать следующий протокол. Вспомогательные реагенты можно также заказать в компании Lumiprobe.

Рассчитайте объемы реагентов, необходимых для мечения методом клик-химии, согласно таблице, приведенной ниже. Подготовьте необходимые исходные растворы (см. Приложение).

Реагент	Конечная концентрация в смеси	Концентрация исходного раствора
Олигонуклеотид, алкин-модифицированный	Варьирует (20–200 мкM)	Варьирует
Азид	В 1,5 раза больше конечной концентрации олигонуклеотида	10 мМ в ДМСО
ДМСО	50 об. %	—
Аскорбиновая кислота	0,5 мМ	5 мМ в воде
Медь(II)-TBTA	0,5 мМ	10 мМ в 55 об. % ДМСО

Растворите алкин-модифицированный олигонуклеотид или ДНК в воде в герметичной пробирке.
Добавьте 2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0) до конечной концентрации 0,2 М.
Добавьте ДМСО и перемешайте на вортексе.
Добавьте исходный раствор азида (10 мМ в ДМСО) и перемешайте на вортексе.
Добавьте к смеси требуемый объем 5 мМ исходного раствора аскорбиновой кислоты и кратко перемешайте на вортексе.
Дегазируйте раствор барботированием инертного газа в течение 30 с. Можно использовать азот, аргон или гелий.
Добавьте к смеси необходимое количество 10 мМ исходного раствора меди(II)-ТБТА в 55 об. % ДМСО. Продуйте пробирку инертным газом и закройте крышку.
Тщательно перемешайте смесь на вортексе. Если наблюдается значительное выпадение в осадок азида, нагрейте пробирку в течение 3 мин при 80°C и перемешайте смесь на вортексе.
Оставить на ночь при комнатной температуре.
Осадите конъюгат ацетоном (для олигонуклеотидов) или этанолом (для ДНК).
Для осаждения конъюгата олигонуклеотида:

добавьте к смеси минимум 4-кратный объем 3% раствора перхлората лития в ацетоне (если объем смеси большой, разделите её на несколько пробирок).

Для осаждения конъюгата ДНК:

добавьте ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М к смеси;

добавьте 2,5 объема этанола (или 0,8 объема изопропанола).

Тщательно перемешайте и выдержите в течение 20 мин при −20°C.
Центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
Удалите супернатант.
Промойте осадок ацетоном (1 мл), центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
Удалите супернатант, высушите осадок и очистите конъюгат с помощью ОФ ВЭЖХ или ПААГ.

Приложение. Приготовление исходных растворов реагентов для мечения методом клик-химии.

5 мМ исходный раствор аскорбиновой кислоты

Приготовление	Растворите 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл дистиллированной воды.
Хранение	Аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Раствор стабилен в течение суток. Для клик-химии используйте свежий раствор.

10 мМ исходный раствор меди(II)-TБTA в 55 об. % ДМСО

Приготовление	Растворите 50 мг сульфата меди(II) пятиводного в 10 мл дистиллированной воды. Растворите 116 мг ТБТА (лиганда) в 11 мл ДМСО. Смешайте два раствора.
Хранение	Храните при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0)

Приготовление	Смешайте 2,78 мл триэтиламина с 1,14 мл уксусной кислоты. Добавьте воду до общего объема 10 мл, доведите pH до 7,0.
Хранение	Хранить при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение нескольких лет.

Похожие товары

ATT 550 азид

Азидное производное водорастворимого желтого флуоресцентного красителя ATT 550 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.

Показать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки
1C930	1 mg	$165	в наличии
2C930	5 mg	$640	в наличии
4C930	25 mg	$1640	в наличии
5C930	50 mg	$2090	в наличии
6C930	100 mg	$2840	в наличии

Оптовый заказ

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 565 азид

Азидное производное водорастворимого оранжевого флуоресцентного красителя ATT 565 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.

Показать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки
1A930	1 mg	$165	в наличии
2A930	5 mg	$640	в наличии
4A930	25 mg	$1640	в наличии
5A930	50 mg	$2090	в наличии
6A930	100 mg	$2840	в наличии

Оптовый заказ

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 594 азид

Азидное производное водорастворимого красного флуоресцентного красителя ATT 594 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.

Показать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки
1B930	1 mg	$165	в наличии
2B930	5 mg	$640	в наличии
4B930	25 mg	$1640	в наличии
5B930	50 mg	$2090	в наличии
6B930	100 mg	$2840	в наличии

Оптовый заказ

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 633 азид

Азидное производное водорастворимого дальнего красного флуоресцентного красителя ATT 633 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.

Показать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки
1D930	1 mg	$110	в наличии
2D930	5 mg	$540	в наличии
4D930	25 mg	$1640	в наличии
5D930	50 mg	$2090	в наличии
6D930	100 mg	$2840	в наличии

Оптовый заказ

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

Cu(II)-TBTA комплекс

Катализатор для клик-реакции. Стабильный комплекс меди (II), который должен быть переведен в одновалентную медь (I) с помощью восстановителей. Комплекс может быть использован для приготовления реакционного буфера любого состава.

Показать цены