Клик-химия — это совокупность разнообразных реакций, которые могут быть использованы для синтеза различных конъюгатов. Практически любую биомолекулу можно легко пометить путем конъюгации с небольшими молекулами, такими как флуоресцентные красители, биотин и др., методом клик-химии. Реакция клик-химии происходит между двумя компонентами: азидом и алкином (терминальным ацетиленом). Поскольку азидная и алкиновая группы практически не встречаются в природных биомолекулах, реакции между ними отличаются высокой биоортогональностью и специфичностью. При необходимости пометить олигонуклеотид, можно заказать его алкин-модифицированную форму.

Протокол

Для мечения алкин-модифицированных олигонуклеотидов с помощью азидов производства компании Lumiprobe, мы рекомендуем использовать следующий протокол. Вспомогательные реагенты можно также заказать в компании Lumiprobe.

1. Рассчитайте объемы реагентов, необходимых для мечения методом клик-химии, согласно таблице, приведенной ниже. Подготовьте необходимые исходные растворы (см. Приложение).

   Реагент	Конечная концентрация в смеси	Концентрация исходного раствора
   Олигонуклеотид, алкин-модифицированный	Варьирует (20–200 мкM)	Варьирует
   Азид	В 1,5 раза больше конечной концентрации олигонуклеотида	10 мМ в ДМСО
   ДМСО	50 об. %	—
   Аскорбиновая кислота	0,5 мМ	5 мМ в воде
   Медь(II)-TBTA	0,5 мМ	10 мМ в 55 об. % ДМСО

2. Растворите алкин-модифицированный олигонуклеотид или ДНК в воде в герметичной пробирке.
3. Добавьте 2 М триэтиламмоний-ацетатный буфер (рН 7,0) до конечной концентрации 0,2 М.
4. Добавьте ДМСО и перемешайте на вортексе.
5. Добавьте исходный раствор азида (10 мМ в ДМСО) и перемешайте на вортексе.
6. Добавьте к смеси требуемый объем 5 мМ исходного раствора аскорбиновой кислоты и кратко перемешайте на вортексе.
7. Дегазируйте раствор барботированием инертного газа в течение 30 с. Можно использовать азот, аргон или гелий.
8. Добавьте к смеси необходимое количество 10 мМ исходного раствора меди(II)-ТБТА в 55 об. % ДМСО. Продуйте пробирку инертным газом и закройте крышку.
9. Тщательно перемешайте смесь на вортексе. Если наблюдается значительное выпадение в осадок азида, нагрейте пробирку в течение 3 мин при 80°C и перемешайте смесь на вортексе.
10. Оставить на ночь при комнатной температуре.
11. Осадите конъюгат ацетоном (для олигонуклеотидов) или этанолом (для ДНК).

    Для осаждения конъюгата олигонуклеотида:

    добавьте к смеси минимум 4-кратный объем 3% раствора перхлората лития в ацетоне (если объем смеси большой, разделите её на несколько пробирок).

    Для осаждения конъюгата ДНК:

    добавьте ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М к смеси;

    добавьте 2,5 объема этанола (или 0,8 объема изопропанола).

    Тщательно перемешайте и выдержите в течение 20 мин при −20°C.

12. Центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
13. Удалите супернатант.
14. Промойте осадок ацетоном (1 мл), центрифугируйте при 10000 об/мин в течение 10 мин.
15. Удалите супернатант, высушите осадок и очистите конъюгат с помощью ОФ ВЭЖХ или ПААГ.