Протокол конъюгации олигонуклеотидов, модифицированных алкином, с азидами красителей

Каталитический буфер для клик-химии предназначен для постсинтетической конъюгации олигонуклеотидов, содержащих алкиновую группу. Олигонуклеотиды с терминальным алкином могут быть синтезированы с использованием модифицирующего амидита, или вы можете заказать синтез модифицированных олигонуклеотидов у нас на сайте.

Реакция конъюгации происходит между азидом и терминальной группой алкина модифицированного олигонуклеотида и приводит к образованию пятичленного гетероцикла. Поскольку обе группы (азида и алкина) практически не встречаются в природных биомолекулах, реакция является высокоспецифичной и эффективной для решения широкого спектра задач.

Scheme of copper catalyzed Click chemistry alkyne azide cycloaddition

Реакция протекает в присутствии меди (I) и при нейтральных значениях pH. Каталитический буфер содержит медь (II), ацетат триэтиламмония pH 7 и DMSO. Для восстановления меди (II) рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты.

Для проведения реакции вам понадобятся: модифицированный алкином олигонуклеотид, азид красителя, каталитический буфер и аскорбиновая кислота. Все реагенты вы можете заказать у нас на сайте.

Протокол

Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации алкин-содержащих олигонуклеотидов с азидами красителей:

  1. Определите общий объем реакции исходя из используемого количества олигонуклеотида:
    Общий объём реакции, мкл Количество олигонуклеотида
    100 от 4 до 20 нмоль
    200 от 20 до 40 нмоль
    400 от 40 до 80 нмоль
    600 от 80 до 600 нмоль
  2. Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:
    Реагент Объем, мкл Концентрация стокового раствора
    Азид красителя (количество олигонуклеотида [нмоль]) × 0.15 10 мМ в ДМСО
    Каталитический буфер для клик-химии (общий объем реакции [мкл]) × 0.67 1.5х
    Активатор
    (аскорбиновая кислота)
    (общий объем реакции [мкл]) × 0.02 50 мМ в воде
    Вода (для растворения олигонуклеотида) (общий объем реакции [мкл] — объем раствора азида красителя [мкл] — объём каталитического буфера [мкл] — объём раствора активатора [мкл])
  3. Приготовьте стоковый раствор азида красителя (10 мМ в ДМСО) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде).
    Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
  4. Растворите олигонуклеотид в рассчитанном объеме воды в 2 мл пластиковой пробирке.
  5. Добавьте каталитический буфер для клик-химии и размешайте на вортексе.
  6. Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
  7. (рекомендуется). Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом, гелием). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 сек.
    Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать прибор типа SpeedVac. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 сек включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
  8. Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройтее ее.
  9. Размешайте раствор на вортексе. Если в процессе реакции заметно образование осадка, нагрейте пробирку в горячей (70–95 ºC) воде до растворения осадка и размешайте раствор на вортексе.
  10. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
  11. Добавьте 2 M раствор перхлората лития (из расчета один объем на 5 объемов реакционной смеси), размешайте раствор на вортексе и добавьте ацетон квалификации «ос. ч.» до 2 мл.
  12. Взболтайте пробирку и выдержите 20 мин при −20 °C.
  13. Отделите осадок центрифугированием 10000 об/мин, 10 мин. Удалите супернатант.
  14. Добавьте к осадку 1 мл ацетона. Встряхните пробирку несколько раз и отделите осадок центрифугированием 10000 об/мин, 10 мин. Удалите супернатант.
  15. Высушите осадок при комнатной температуре в открытой пробирке в течение 1 часа или поместите пробирку в термостат при 65 °C на 10 мин.
  16. Растворите осадок в воде и очистите целевой продукт с помощью ВЭЖХ.

Related products

Каталитический буфер для Click chemistry, 1.5x

Каталитический буфер для Click chemistry, подходит для модификации нуклеиновых кислот и малых молекул.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
61150 55 mL $49.00 в наличии

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.