Конъюгация алкин-модифицированных олигонуклеотидов с азидами красителей

Протокол

Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации алкин-содержащих олигонуклеотидов с азидами красителей:

1. Определите общий объем реакции исходя из используемого количества олигонуклеотида:

   Количество олигонуклеотида	Общий объём реакции, мкл
   от 4 до 20 нмоль	100
   от 20 до 40 нмоль	200
   от 40 до 80 нмоль	400
   от 80 до 600 нмоль	600

2. Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:

   Реагент	Объем, мкл	Концентрация стокового раствора
   Азид красителя	(количество олигонуклеотида [нмоль]) × 0.15	10 мМ в ДМСО
   Каталитический буфер для клик-химии	(общий объем реакции [мкл]) × 0.67	1.5х
   Активатор (аскорбиновая кислота)	(общий объем реакции [мкл]) × 0.02	50 мМ в воде
   Вода (для растворения олигонуклеотида)	(общий объем реакции [мкл] — объем раствора азида красителя [мкл] — объём каталитического буфера [мкл] — объём раствора активатора [мкл])	—

3. Приготовьте стоковый раствор азида красителя (10 мМ в ДМСО) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде).
   Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
4. Растворите олигонуклеотид в рассчитанном объеме воды в 2 мл пластиковой пробирке.
5. Добавьте каталитический буфер для клик-химии и размешайте на вортексе.
6. Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
7. (рекомендуется). Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом, гелием). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 сек.
   Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать прибор типа SpeedVac. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 сек включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
8. Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройтее ее.
9. Размешайте раствор на вортексе. Если в процессе реакции заметно образование осадка, нагрейте пробирку в горячей (70–95 ºC) воде до растворения осадка и размешайте раствор на вортексе.
10. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
11. Добавьте 2 M раствор перхлората лития (из расчета один объем на 5 объемов реакционной смеси), размешайте раствор на вортексе и добавьте ацетон квалификации «ос. ч.» до 2 мл.
12. Взболтайте пробирку и выдержите 20 мин при −20 °C.
13. Отделите осадок центрифугированием 10000 об/мин, 10 мин. Удалите супернатант.
14. Добавьте к осадку 1 мл ацетона. Встряхните пробирку несколько раз и отделите осадок центрифугированием 10000 об/мин, 10 мин. Удалите супернатант.
15. Высушите осадок при комнатной температуре в открытой пробирке в течение 1 часа или поместите пробирку в термостат при 65 °C на 10 мин.
16. Растворите осадок в воде и очистите целевой продукт с помощью ВЭЖХ.