Инструкция к набору QuDye® dsDNA HS Rapid для определения количества двухцепочечной ДНК

Набор QuDye® dsDNA HS Rapid предназначен для быстрой и высокочувствительной количественной оценки двухцепочечной ДНК методом флуоресценции на флуориметре (например, QuReader 1, QuReader 8 и др.).

Входящий в состав набора рабочий раствор красителя (QuDye dsDNA HS Working solution, 1×) полностью готов к использованию и не требует дополнительных операций по его разбавлению.

Все поставляемые реагенты оптимизированы для работы на флуориметре. Диапазон измеряемых концентраций ДНК составляет 10 пг/мкл—100 нг/мкл для исходного образца.

Состав набора

Прежде чем начать

• Все измерения с использованием набора QuDye® dsDNA HS Rapid должны проводиться при комнатной температуре (22–28°С).
• Перед началом работы прогрейте все необходимые растворы до комнатной температуры.
• Избегайте нагрева образцов, в частности, не держите в руках пробирки с образцами непосредственно перед измерениями на флуориметре, так как результаты измерений зависят от температуры пробы.

Постановка реакции

1. Подготовьте две пластиковые пробирки для стандартов и по одной на каждый исследуемый образец. Промаркируйте только крышки.
2. В пробирки для стандартов внесите по 190 мкл готового рабочего раствора (QuDye dsDNA HS Working solution, 1×) и по 10 мкл стандартов: Стандарт #1 (Quantitative standard, 0 нг/мкл и Стандарт #2 (dsDNA Quantitative standard, 10 нг/мкл).
3. В каждую пробирку для исследуемых образцов внесите от 180 до 199 мкл готового рабочего раствора и от 20 до 1 мкл образца. Общий объем реакции — 200 мкл.
4. Перемешайте содержимое пробирок на вортексе (2–3 с), сбросьте капли коротким центрифугированием.

5. Подберите разведение образца так, чтобы диапазон количества ДНК в пробирке для измерения был в пределах 0,2–100 нг. Пример: для образца 10 пг/мкл — 20 мкл образца + 180 мкл рабочего раствора (итог: 0,2 нг ДНК); для образца 100 нг/мкл — 1 мкл образца + 199 мкл рабочего раствора (итог: 100 нг ДНК).
   Важно! Избегайте использование слишком малых объемов для внесения образца, чтобы минимизировать ошибки при дозировании.

6. Инкубируйте все пробирки (стандарты и образцы) при комнатной температуре (22–28°C) в течение 5 мин.

Измерение флуоресценции

1. Измерение интенсивности флуоресценции следует выполнять согласно инструкции к флуориметру. В зависимости от версии флуориметра пункты меню могут отличаться от приведенных ниже.
2. Используйте режим dsDNA High Sensitivity на флуориметре.
3. При новой постановке или изменении условий желательно провести новую калибровку флуориметра на двух стандартах (Quantitative standard, 0 нг/мкл и dsDNA Quantitative standard, 10 нг/мкл).
4. Последовательно измерьте первый стандарт, второй стандарт и затем экспериментальные образцы.

Расчет концентрации ДНК

1. Находясь во вкладке Sample, поместите в гнездо флуориметра пробирку с экспериментальным образцом.
2. Закройте крышку, нажмите Read.
3. После завершения измерения прибор покажет на экране значение QF. Значение QF представляет собой концентрацию ДНК после разбавления исходного образца в пробирке для измерения.
4. Рассчитайте исходную концентрацию ДНК по формуле:
   Концентрация ДНК в исходном образце (нг/мл) = QF × 200/V, где
   • V — объем исходного образца в мкл, который был добавлен в пробирку для измерения,
   • QF — результат измерения на экране флуориметра (нг/мл).
5. Повторите процедуру для всех экспериментальных образцов.
6. Для расчета концентрации ДНК в исходном образце Вы также можете воспользоваться калькулятором на флуориметре (Dilution Calculator).