Окрашивание живых клеток флуоресцентным красителем для нуклеиновых кислот LUCS® 13

LUCS^® 13 — проникающий в клетки ядерный краситель, имеющий яркую зеленую флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами. LUCS^® 13 используют для окрашивания РНК и ДНК как в живых, так и в мертвых эукариотических клетках, а также грамположительных и грамотрицательных бактерий. В отличие от DAPI и Hoechst 33342, LUCS 13 не является чисто ядерным красителем, и помимо окрашивания ядер, он также демонстрирует диффузное окрашивание цитоплазмы и митохондрий живых клеток.

Краситель может использоваться совместно с непроникающими в живые клетки ядерными маркерами, такими как YoDi-3, для оценки клеточной выживаемости методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Краситель возбуждается при 488 нм, эмиссия регистрируется во флуоресцеиновом канале с пиком 509 нм после связывания с ДНК и 514 нм после связывания с РНК.

LUCS^® 13 является полным структурным аналогом SYTO^®13.

Протокол

Точный протокол зависит от конкретного типа клеток и экспериментальной задачи. В общем он может быть описан следующим образом:

1. Для приготовления рабочего 1 мкМ раствора LUCS^® 13 добавьте 1 мкл 5 мМ раствора LUCS^® 13 в 5000 мкл PBS.
2. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
3. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4). Осадите клетки центрифугированием 5 мин при 300 g.
4. Инкубируйте клетки в 1 мл 1 мкМ рабочего раствора LUCS^® 13 в течение 30 мин при 37°С.
5. Удалите раствор красителя центрифугированием 5 мин при 300 g.
6. Отмойте клетки однократно с помощью PBS.
7. (Опционально) При необходимости клетки можно зафиксировать в 3,7% растворе формальдегида в PBS в течение 15 мин, отмыть PBS и докрасить другим красителем.

Важно

• Используйте пластиковые пробирки при работе с растворами LUCS^® 13, поскольку разведенный краситель может прилипать к стеклу.
• Более яркое окрашивание может быть получено с буферами, не содержащими фосфатов (например, 15 мМ HEPES в физиологическом растворе).
• Перед началом эксперимента протестируйте несколько концентраций красителя в диапазоне от 10 нМ до 5 мкМ, чтобы определить наиболее оптимальное разведение красителя. На результат окрашивания влияет ряд факторов: среда для выращивания, плотность клеток, наличие других типов клеток, длительность окрашивания и др.