Окрашивание клеток красителем Lucifer Yellow CH

Lucifer Yellow CH — высокочувствительный флуоресцентный краситель, широко применяемый в нейробиологии, цитологии и молекулярной биологии для трекинга клеток, изучения межклеточных взаимодействий и визуализации нейронов.

Lucifer Yellow CH подходит для мечения как живых, так и фиксированных препаратов методами микроинъекции, ионтофореза и электропорации [1]. Благодаря наличию карбогидрозидной группы (CH) в составе, краситель сохраняется в клетках после фиксации альдегидами (например, параформальдегидом или глутаральдегидом), что делает его совместимым с большинством протоколов иммуногисто- и цитохимии.

Lucifer Yellow CH имеет высокий квантовый выход и устойчив к фотообесцвечиванию, благодаря чему идеально подходит для конфокальной и флуоресцентной микроскопии. Краситель также обладает свойством фотоконверсии и может быть использован для визуализации меченых клеточных структур методами светлопольной и электронной микроскопии [2].

Прежде чем начать

  • Поскольку Lucifer Yellow CH имеет два отрицательных заряда, он не проникает через интактные мембраны живых клеток, поэтому основными способами введения красителя в клетки являются микроинъекция, ионтофорез и электропорация.
  • Несмотря на то, что Lucifer Yellow CH является гидрофильным соединением, некоторые клетки способны поглощать его путем эндоцитоза и могут быть помечены таким образом.
  • Lucifer Yellow CH не подходит для долгосрочного трекинга в живых клетках из-за постепенного вымывания красителя.
  • Для одновременного мечения с другими флуорофорами (например, DAPI) убедитесь в отсутствии спектрального перекрытия.

Приготовление рабочего раствора

  1. Растворите Lucifer Yellow CH в дистиллированной воде, 0,5–1 М LiCl или культуральной среде до концентрации 0,2–5%. Выбор растворителя и концентрации красителя зависят от используемого метода загрузки. Приведенные концентрации Lucifer Yellow CH могут быть использованы в качестве отправных, точная концентрация красителя определяется опытным путем.
  2. Отфильтруйте полученный раствор через 0,22 мкм сито для удаления нерастворенных частиц.
  3. Храните раствор при 4°C в защищенном от света месте не более 1 месяца.
  4. Неиспользованный раствор также можно хранить при −20°C или −80°C в защищенном от света месте. Избегайте повторного замораживания и размораживания.

Загрузка красителя микроинъекцией

  1. Заполните микроинъекционную иглу 1–5% раствором Lucifer Yellow CH в бидистиллированной воде. Точная концентрация красителя определяется опытным путем.
  2. Поместите клетки или срез ткани на предметный столик флуоресцентного микроскопа, оснащенного микроманипулятором.
  3. Введите краситель в целевую клетку под контролем микроскопа.
  4. Инкубируйте 10–15 мин при комнатной температуре.
  5. После инъекции промойте образец, чтобы удалить избыток невключившегося красителя.
  6. Визуализируйте окрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующим набором фильтров (максимум возбуждения при ~430 нм, максимум испускания при ~540 нм).

Загрузка красителя ионтофорезом

  1. Приготовьте рабочий 1–2% раствор красителя Lucifer Yellow CH в 0,5–1 М LiCl. Для ионтофоретической инъекции предпочтительнее использовать этот растворитель, поскольку он увеличивает подвижность красителя. Точная концентрация красителя определяется опытным путем.
  2. Заполните стеклянный микроэлектрод рабочим раствором Lucifer Yellow CH.
  3. Поместите клетки или срез ткани на предметный столик флуоресцентного микроскопа, оснащенного микроманипулятором.
  4. Используйте микроманипулятор для введения микроэлектрода в нужную клетку под визуальным контролем.
  5. Подайте отрицательный импульс тока (например, 0,2–0,5 нА в течение 5–15 мин) для загрузки отрицательно заряженного Lucifer Yellow CH в клетку.
  6. После инъекции промойте образец, чтобы удалить избыток невключившегося красителя.
  7. Визуализируйте окрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующим набором фильтров (максимум возбуждения при ~430 нм, максимум испускания при ~540 нм).

Загрузка красителя электропорацией

  1. Приготовьте 0,2–0,5% рабочий раствор Lucifer Yellow CH в культуральной среде без кальция.
  2. Промойте клетки свежей культуральной средой без кальция, избегая их подсушивания.
  3. Перенесите клетки в камеру для электропорации.
  4. Добавьте к клеткам 400 мкл рабочего раствора Lucifer Yellow CH.
  5. Подайте электрический импульс с помощью устройства для электропорации в соответствии с инструкцией производителя.
  6. Немедленно замените раствор красителя предварительно нагретой средой без кальция, содержащей 10% диализованной сыворотки. Это поможет закрыть поры, образовавшиеся во время электропорации.
  7. Инкубируйте клетки в течение 3–5 мин в инкубаторе для закрытия пор и переноса красителя через щелевые контакты.
  8. Промойте клетки свежей средой для удаления невключенного красителя.
  9. Визуализируйте окрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующим набором фильтров (максимум возбуждения при ~430 нм, максимум испускания при ~540 нм).

Фотоконверсия

Lucifer Yellow CH позволяет визуализировать меченые клеточные структуры методами светлопольной и электронной микроскопии, благодаря образованию стабильного оптически и электронно-плотного осадка после фотоокисления интенсивным синим светом в присутствии раствора диаминобензидина (DAB) [2].

  1. Инкубируйте образец в блокирующем буфере (50 мМ глицина, 5 мМ KCN и 5 мМ аминотриазола) в течение 15 мин для снижения неспецифической фоновой реакции производных диаминобензидина. Тщательно отмойте после инкубации.
  2. Добавьте к образцу отфильтрованный 0,1–0,2% раствор диаминобензидина и инкубируйте в течение 10–20 мин при комнатной температуре.
  3. Поместите образец под микроскоп, оснащенный источником света. Осветите целевую область интенсивным синим светом (например, ксеноновой лампой мощностью 150 Вт). Для возбуждения Lucifer Yellow CH используйте набор фильтров FITC.
    (Опционально) Постоянный поток чистого кислорода через раствор во время фотоокисления значительно усиливает реакцию.
  4. Прекратите освещение образца, когда в меченых клетках появится светло-коричневое окрашивание, указывающее на образование видимого осадка (обычно около 10 мин).
  5. Промойте клетки буфером для удаления несвязавшихся реагентов.
  6. Визуализируйте окрашенные клетки с помощью светлопольного или электронного микроскопа.

Фиксация и пермеабилизация

  1. Для светлопольной, флуоресцентной и конфокальной микроскопии зафиксируйте окрашенные образцы 4% параформальдегидом в течение 10–20 мин при комнатной температуре или 4°C.
  2. Промойте клетки PBS, затем проведите пермеабилизацию 0,1–0,5% раствором Triton X-100 в PBS в течение 5–10 мин. После этого образцы можно окрашиваить стандартными протоколами для иммуноцито- и гистохимии.
  3. Для детекции Lucifer Yellow CH методом электронной микроскопии зафиксируйте образцы последовательно 2,5% глутаральдегидом и 1% OsO4 на 0,1М какодилатном буфере (pH 7,5) в течение 1 и 3 ч, соответственно. После этого образцы могут быть процессированы стандартным образом для электронной микроскопии.

Возможные проблемы и их решение

Слабое окрашивание:
  • Увеличьте концентрацию вводимого Lucifer Yellow CH.
  • Увеличьте объем красителя, вводимого методом микроинъекции.
  • Увеличьте время введения красителя методами ионтофореза или электропорации.
  • Усильте окрашивание с помощью иммунохимии с антителами, специфичными к Lucifer Yellow.
Слабое мечение отростков:
  • Убедитесь, что концентрация Lucifer Yellow CH не слишком высокая. Избыточная концентрация красителя может приводить к его агрегации и снижению диффузии.
  • Проверьте параметры электропорации или микроинъекции, чтобы обеспечить эффективную доставку красителя.
  • Увеличьте время диффузии красителя перед фиксацией.
  • Оптимизируйте этапы фиксации и пермеабилизации, чтобы избежать тушения флуоресценции или блокирования проникновения красителя в отростки.

Ссылки

[1] J. Cell. Mol. Med. 2012. 16(1). pp. 22-31.

[2] Science. 1982. 217. pp. 953–955.

Похожие товары

Lucifer Yellow СН

Высокочувствительный желтый флуоресцентный краситель, широко применяемый в нейробиологии, цитологии и молекулярной биологии для трекинга клеток, изучения межклеточных взаимодействий и визуализации нейронов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
5109-25mg 25 mg
$105
 в наличии
5109-100mg 100 mg
$299
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.