Years on Market
20

Инструкция к наборам для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V AF и йодистого пропидия

Руководство пользователя к набору для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с красителями AF 488/AF 647, и йодистого пропидия.

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1].

Изображение

Одним из ранних проявлений программируемой клеточной гибели (апоптоза) является нарушение асимметрии фосфолипидного бислоя. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным аннексином V. Данная транслокация опосредована активацией скремблазы Xkr8, после ее расщепления эффекторной каспазой-3. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), связывание аннексина V с ФС позволяет различать популяции здоровых (Аннексин−PI−), апоптотических (Аннексин+PI−) и некротических (Аннексин+PI+) клеток [2] и проводить количественный анализ клеточной гибели в результате апоптоза и/или некроза.

Йодистый пропидий (PI) — непроникающий через плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

Наборы для определения апоптотических клеток содержат все необходимые реагенты для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с красителем AF 488 или AF 647, и йодистого пропидия.

Состав набора

Компонент набораКоличество
11172
10 assays		21172
50 assays		14172
10 assays		24172
50 assays
Аннексин V, AF 488 конъюгат1———
Аннексин V, AF 488 конъюгат—1——
Аннексин V, AF 647 конъюгат——1—
Аннексин V, AF 647 конъюгат———1
Буфер для связывания аннексина V, 5×1111
Пропидий Йодистый1111

Рекомендуемые концентрации аннексина V AF — от 2 до 10 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V AF для определения оптимальной концентрации.

Окрашивание с помощью йодистого пропидия — опционально. Этот этап можно пропустить, если в задачах нет необходимости исследовать некроз.

Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Приготовление растворов

  1. Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V AF (11515, 12515) в 50 мкл деионизованной воды. / Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V AF (21515, 22515) в 250 мкл деионизованной воды.
    Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!
  2. Приготовьте необходимый объём 1× буфера для связывания, смешав 1 часть 5× буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.

Окрашивание клеток

  1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
  2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7,4) и один раз 1× буфером для связывания.
  3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1× буфере для связывания.
  4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×105 до 1×106 клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).
  5. Добавьте 5-10 мкл раствора аннексина V AF в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
  6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
  7. (Опционально) Добавьте 0,5-1 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.
  8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.
    Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.

Проточная цитометрия

  1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V AF и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V AF, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).
  2. Анализ связывания аннексина V AF 488 проводят с использованием детектора сигнала FITC. / Анализ связывания аннексина V AF 647 проводят с использованием детектора сигнала Cy5/AF 647.
  3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.

Флуоресцентная микроскопия

  1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
  2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
  3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V AF, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
  4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя соответствующий набор фильтров.

Результат окрашивания

  • Ранние апоптотические клетки, связавшие аннексин V AF 488/аннексин V AF 647, окрашиваются в зеленый/дальний красный цвет в плазматической мембране.
  • Некротические клетки в результате проникновения йодистого пропидия внутрь клетки будут окрашены красным.
  • Апоптотические клетки с нарушенной в результате вторичного некроза целостностью мембраны будут иметь красное окрашивание (йодистый пропидий) и ореол зеленого/дальне-красного окрашивания (AF 488/AF 647) на клеточной поверхности (плазматическая мембрана).
  • Здоровые клетки будут лишены окрашивания.

Ссылки

[1] Blood. 1994, 84, 5, 1415-1420. [2] J. Exp. Med. 1995, 182, 5, 1545-1556.

Наборы