Инструкция к наборам для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF и йодистого пропидия

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1].

Одним из ранних проявлений программируемой клеточной гибели (апоптоза) является нарушение асимметрии фосфолипидного бислоя. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным аннексином V. Данная транслокация опосредована активацией скремблазы Xkr8, после ее расщепления эффекторной каспазой-3. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), связывание аннексина V с ФС позволяет различать популяции здоровых (Аннексин⁻PI⁻), апоптотических (Аннексин⁺PI⁻) и некротических (Аннексин⁺PI⁺) клеток [2] и проводить количественный анализ клеточной гибели в результате апоптоза и/или некроза.

Йодистый пропидий (PI) — непроникающий через плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

Наборы для определения апоптотических клеток содержат все необходимые реагенты для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с красителем AF 488 или AF 647, и йодистого пропидия.

Состав набора

Компонент набора	Количество
Компонент набора	11172 10 assays	21172 50 assays	14172 10 assays	24172 50 assays
11515, Аннексин V-AF 488 конъюгат, 1 ug	1	—	—	—
21515, Аннексин V-AF 488 конъюгат, 5 ug	—	1	—	—
12515, Аннексин V-AF 647 конъюгат, 1 ug	—	—	1	—
22515, Аннексин V-AF 647 конъюгат, 5 ug	—	—	—	1
19010, Пропидий Йодистый, 100 uL, 0.1 mg/mL in water	1	1	1	1
83215, Буфер для связывания аннексина V, 5х, 15 mL	1	1	1	1

Транспортировка: до одной недели при комнатной температуре. Хранение: при -20°С.

Срок хранения 9 месяцев.

Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF — от 2 до 5 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF для определения оптимальной концентрации.

Окрашивание с помощью йодистого пропидия — опционально. Этот этап можно пропустить, если в задачах нет необходимости исследовать некроз.

Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Приготовление растворов

Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF (11515, 12515) в 50 мкл деионизованной воды. / Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF (21515, 22515) в 250 мкл деионизованной воды.
Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!
Приготовьте необходимый объём 1х буфера для связывания, смешав 1 часть 5х буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.

Окрашивание клеток

Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.
Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.
Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).
Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
(Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.
Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.
Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.

Проточная цитометрия

Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).
Анализ связывания аннексина V-AF 488 проводят с использованием детектора сигнала FITC. / Анализ связывания аннексина V-AF 647 проводят с использованием детектора сигнала Cy5/Alexa Fluor 647.
Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.

Флуоресцентная микроскопия

Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
(Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя соответствующий набор фильтров.

Результат окрашивания

Ранние апоптотические клетки, связавшие аннексин V-AF 488/аннексин V-AF 647, окрашиваются в зеленый/дальний красный цвет в плазматической мембране.
Некротические клетки в результате проникновения йодистого пропидия внутрь клетки будут окрашены красным.
Апоптотические клетки с нарушенной в результате вторичного некроза целостностью мембраны будут иметь красное окрашивание (йодистый пропидий) и ореол зеленого/дальне-красного окрашивания (AF 488/AF 647) на клеточной поверхности (плазматическая мембрана).
Здоровые клетки будут лишены окрашивания.