Инструкция к набору dsGreen® для кПЦР лиофилизированный

Набор для кПЦР dsGreen® лиофилизированный применяется для точного определения содержания ДНК матрицы в пробе и подходит для определения копийности и уровня экспрессии генов, а также генотипирования методом кПЦР. Для детекции в наборе используется интеркалирующий краситель dsGreen структурный .

Реакционная смесь в наборе не содержит референсный краситель ROX, что позволяет её использовать с real-time амплификаторами любого типа.

Полимераза с технологией «горячего старта», входящая в состав набора, предотвращает неспецифическую амплификацию ДНК. Объём смеси 1 мл рассчитан на проведение 100 реакций объёмом 20 мкл.

Состав набора

Компонент набора	Количество
Компонент набора	32162 100 реакций
31315, Лиофилизированная полимераза Taq с горячим стартом, 100 rxn	1
51215, Буфер для растворения полимеразы, 1 mL	1
11010, dsGreen для ПЦР реального времени, 100×, 100 uL	1

Транспортировка: до трех недель при комнатной температуре. Хранение: при −20°С.

Срок хранения 12 месяцев.

Совместимость с оборудованием: совместим с real-time амплификаторами любого типа.

Протокол

Растворите лиофилизированную смесь (Компонент #1) буфером для ресуспендирования (Компонент #2). Для этого добавьте весь объём буфера для ресуспендирования (Компонент #2) в пробирку с лиофилизированной смесью (Компонент #1). Тщательно перемешайте и дождитесь полного растворения фермента (~5 минут).
Добавьте в пробирку 20 мкл dsGreen для ПЦР реального времени, 100x (Компонент #3). Тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
Важно! Храните реакционную смесь после растворения и добавления красителя dsGreen в морозильной камере (−20°С).

Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте на вортексе и сбросьте капли центрифугированием.

Важно! Объём реакции может варьироваться в зависимости от конкретной задачи, однако объём реакции менее 10 мкл не рекомендуется.

Расчет на 1 реакцию объёмом 20 мкл:
При использовании другого объёма реакции следует пересчитать объёмы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций.

Компонент	Объём	Примечание
2х Реакционная смесь	10 мкл	—
Прямой праймер	0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора	5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 250–750 нМ)
Обратный праймер	0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора	5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 250–750 нМ)
Деионизованная вода	Добавляется до общего объёма реакции 20 мкл
ДНК	2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)	Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
Общий объём реакции	20 мкл

В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объёма образца ДНК. Образцы ДНК внесите отдельно в каждую пробирку, сбросьте капли центрифугированием.
Важно! Для получения воспроизводимых результатов реакцию рекомендуется ставить в двух и более повторах для каждого образца ДНК.

Программа амплификации

Для расчёта температуры плавления (Tm) праймеров рекомендуется использовать стандартные инструменты, работающие по алгоритму Nearest-Neighbor (SantaLucia J. Jr., 1998). Температура отжига праймеров рассчитывается по формуле Ta=Tm-5°С.

Если температура отжига праймеров ≥60°С:

Стадия	Температура	Время	Число циклов
Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
Денатурация	95°С	10 сек	40
Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией (На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)	60–72°С	30–60 сек	40

Если температура отжига праймеров <60°С:

Стадия	Температура	Время	Число циклов
Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
Денатурация	95°С	10 сек	40
Отжиг праймеров (На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)	55–59°С	10–15 сек
Элонгация	72°С	15–30 сек

Важно! После проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°С.

Наборы

Набор dsGreen для кПЦР лиофилизированный

Лиофилизированный, готовый к использованию набор для проведения количественной ПЦР с Taq полимеразой с горячим стартом и красителем для детекции двухцепочечной ДНК dsGreen. Обладающие ферментативной активностью компоненты лиофильно высушены, что позволяет транспортировать их при комнатной температуре.

Показать цены