НаборБуфер для разведения PKH
Буфер для мечения клеточных мембран красителями серии PKH.
Протокол мечения клеточных мембран красителями PKH2, PKH26 и PKH800.
Цианиновые красители семейства PKH содержат в структуре липофильные группы, позволяющие им быстро и нековалентно встраиваться в клеточные мембраны практически любых клеток, не влияя на клеточные рецепторы или трансмембранные белки. При этом клетки сохраняют свои биологические свойства и способность к пролиферации, что делает PKH красители подходящими для изучения как растительных, так и животных клеток in vivo и in vitro. Эти красители также подходят для изучения мембранных везикул.
Данный набор содержит все необходимые реагенты для мечения мембран клеток красителями PKH с целью последующей оценки клеточной миграции или пролиферации.
Состав набора
| Компонент набора | Количество | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 13201 100 uL dye, 1x buffer | 23201 100 uL dye, 5x buffer | 33201 500 uL dye, 1x buffer | 43201 500 uL dye, 5x buffer | 14201 100 uL dye, 1x buffer | 24201 100 uL dye, 5x buffer | 34201 500 uL dye, 1x buffer | 44201 500 uL dye, 5x buffer | 17201 100 uL dye, 1x buffer | 27201 100 uL dye, 5x buffer | 37201 500 uL dye, 1x buffer | 47201 500 uL dye, 5x buffer | ||
| Буфер для разведения PKH, 1x | 5 | — | 25 | — | 5 | — | 25 | — | 5 | — | 25 | — | |
| Буфер для разведения PKH, 5x | — | 1 | — | 5 | — | 1 | — | 5 | — | 1 | — | 5 | |
| Краситель PKH2, 1mM раствор в изопропаноле | — | — | — | — | 1 | 1 | 5 | 5 | — | — | — | — | |
| Краситель PKH26, 1mM раствор в изопропаноле | 1 | 1 | 5 | 5 | — | — | — | — | — | — | — | — | |
| Краситель PKH800, 1mM раствор в изопропаноле | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 | 1 | 5 | 5 | |
Рекомендации по использованию набора
- В зависимости от типа клеток и эксперимента оптимальные концентрации красителя и клеток могут отличаться, поэтому рекомендуется оценивать жизнеспособность клеток, гомогенность и интенсивность флуоресценции после окрашивания.
- Не используйте растворы, содержащие азиды, при окрашивании красителями PKH.
- Более однородное окрашивание достигается при использовании суспензии клеток.
Протокол
Протокол использования набора для мечения клеточных мембран красителями PKH на примере адгезионной культуры RAW264.7, 1×106 клеток в образце, финальная концентрация красителей PKH — 2 µМ, финальный объем 200 мкл.
- Непосредственно перед окрашиванием приготовьте раствор красителя PKH. Добавьте 1 мкл раствора красителя PKH (PKH dye, 1 mM solution in isopropanol) к 9 мкл 96%-ого этанола, и 4 мкл полученного раствора добавьте к 100 мкл PKH Dyes Diluent, 1×. *1× PKH Dyes Diluent поставляется либо в готовой форме (K6150, PKH Dyes Diluent, 1×), либо в виде 5× концентрата (K7150, PKH Dyes Diluent, 5×). Для разбавления 5× PKH Dyes Diluent используйте стерильную бидистиллированную воду.
- Культуру клеток снимите с подложки скребком в растворе Хенкса (HBSS). Проведите подсчет клеток в образце. Далее добавьте 3 мл раствора Хенкса, центрифугируйте при 400 × g 6 мин при комнатной температуре. *Сывороточные белки и липиды также связывают краситель, поэтому рекомендуется однократно промывать клетки бессывороточной средой или фосфатно-солевым буфером.
- Супернатант удалите полностью пипеткой, необходимое количество клеток (например, 106 клеток) ресуспендируйте в 100 мкл PKH Dyes Diluent, 1×. Далее добавьте 100 мкл полученного на первом шаге раствора красителя PKH. Пипетируйте и оставьте при комнатной температуре на 5 мин. Конечная концентрация красителя PKH в растворе с клетками — 2 µМ. *Для воспроизводимых результатов важно минимизировать количество супернатанта перед ресуспендированием клеток. *Не оставляйте клетки в PKH Dyes Diluent в течение длительного времени. *Поскольку окрашивание происходит практически мгновенно, быстрое диспергирование клеток в растворе красителя имеет важное значение для яркого, однородного и воспроизводимого мечения.
- Добавьте 2 мл фетальной бычьей сыворотки для остановки реакции, инкубируйте 1 мин. Центрифугируйте при 400 × g 10 мин при комнатной температуре. *Не используйте для остановки реакции бессывороточную среду или буферные растворы, которые вызывают образование агрегатов красителя.
- Супернатант удалите, ресуспендируйте клетки в 5 мл полной питательной среды, перенесите в новую пробирку. Отберите аликвоты для оценки жизнеспособности трипановым синим. Центрифугируйте при 400 × g 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируйте клетки в буфере, необходимом для дальнейшего анализа (микроскопия, проточная цитофлуориметрия и др.). *Окрашенные клетки можно фиксировать 2%-м параформальдегидом, и окраска остается стабильной в течение не менее 3 недель, если образцы защищены от света.
Рекомендации по хранению:
Раствор красителей PKH можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике в защищенном от света месте. Рекомендуется проверить раствор на наличие осадка перед использованием. Если в растворе красителя заметен осадок, слегка нагрейте его на водяной бане при +37 °C и обработайте ультразвуком или встряхните до повторного растворения.
Раствор PKH Dyes Diluent поставляется в виде однократного либо пятикратного раствора в стерильной емкости, его рекомендуется хранить в холодильнике и доводить до комнатной температуры непосредственно перед использованием.
Наборы
НаборНаборPKH2, набор для мечения клеточных мембран
Готовый набор для мечения мембран клеток зеленым флуоресцентным красителем PKH2 с целью последующей оценки клеточной миграции или пролиферации.
НаборPKH26, набор для мечения клеточных мембран
Готовый набор для мечения мембран клеток красным флуоресцентным красителем PKH26 с целью последующей оценки клеточной миграции или пролиферации.
НаборPKH800, набор для мечения клеточных мембран
Готовый набор для мечения мембран клеток ближним инфракрасным флуоресцентным красителем PKH800 с целью последующей оценки клеточной миграции или проли...