6-Карбокси-H2DCFDA (6-Карбокси-2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

6-Карбокси-H₂DCFDA является химически восстановленной ацетилированной формой флуоресцеина, который используется в качестве индикатора активных форм кислорода (ROS) в живых клетках. Данный реагент не подходит для работы с фиксированными образцами.

6-Карбокси-H₂DCFDA — нефлуоресцирующее соединение, которое начинает флуоресцировать после отщепления ацетильных групп клеточными эстеразами и окисления его активными формами кислорода внутри клетки. Образующийся при этом 6-карбокси-2′,7′-дихлорофлуоресцеин имеет яркую флуоресценцию в зеленой области спектра (максимум поглощения при 504 нм, максимум флуоресценции при 525 нм), которую можно детектировать методами проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии и планшетными ридерами.

Ацетильные группы в структуре 6-карбокси-H₂DCFDA повышают его липофильность и улучшают проникающую способность реагента через клеточную мембрану. После деацетилирования клеточными эстеразами соединение приобретает заряд, позволяющий ему удерживаться внутри клетки. Карбоксилированный аналог H₂DCFDA имеет два дополнительных отрицательных заряда, которые препятствуют утечке индикатора из клетки.

Рекомендации по использованию реагента:

• Используйте свежеприготовленный раствор реагента (из-за постепенного окисления реагента рабочий раствор не предназначен для долговременного хранения).
• Необходимо подобрать оптимальную рабочую концентрацию реагента и время инкубации, необходимое для деацетилирования и окисления реагента, для клеточной линии и условий эксперимента. Если для используемой клеточной линии нет рекомендуемых протоколов, начните с концентрации в диапазоне 1-10 мкМ и времени инкубации ~30 минут.
• Не инкубируйте краситель с клетками в присутствии сыворотки, так как она содержит ферменты, расщепляющие H₂DCFDA.