Years on Market
20

Амплификация ДНК с реакционной смесью для ПЦР/кПЦР ProbeMaster® Lyo dsGreen

Протокол амплификации ДНК с использованием реакционной смеси для ПЦР/кПЦР ProbeMaster® Lyo dsGreen.

ProbeMaster® Lyo dsGreen — лиофилизированная реакционная смесь, содержащая все необходимые компоненты для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также интеркалирующий краситель dsGreen. Состав смеси оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. Для восстановления смеси в жидкую форму достаточно добавить указанное в инструкции количество воды.

Реакционная смесь ProbeMaster® Lyo dsGreen подходит как для проведения ПЦР в режиме реального времени с помощью интеркалирующего красителя dsGreen, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. Из-за отсутствия в составе UDG/dUTP реакционная смесь может использоваться для рутинных задач по клонированию и других задач, требующих дальнейшего использования продукта ПЦР после амплификации.

Состав реакционной смеси

  • HS Taq ДНК-полимераза;
  • смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов;
  • ПЦР-буфер (содержит Mg2+);
  • интеркалирующий краситель dsGreen;
  • протекторы для лиофилизации.

Ключевые характеристики

  • Одна пробирка лиофилизованной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
  • Смесь полностью готова к применению, что снижает риск контаминации образцов и значительно экономит время на подготовку реакции. Для постановки реакции в смесь необходимо добавить только образец ДНК, праймеры и воду.
  • Подходит для ПЦР фрагментов длиной до 3 тыс. п.о., не более 70% GC, не требующих высокоточной амплификации.
  • В качестве матрицы может использоваться геномная, вирусная, плазмидная ДНК и др.
  • В состав реакционной смеси входит Taq-полимераза с технологией «горячего старта». Используемая HS Taq ДНК-полимераза представляет собой комплекс моноклональных антител с ферментом. Прогрев образца в первом цикле ПЦР приводит к инактивации антител в составе комплекса и активирует фермент. Технология «горячего старта» позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
  • Входящая в состав HS Taq ДНК-полимераза обладает 5′-3′ полимеразной, 5′-3′ экзонуклеазной, аденилтрансферазной активностью, что позволяет использовать продукты ПЦР для ТА-клонирования.
  • Смесь содержит интеркалирующий краситель dsGreen обладающий высокой чувствительностью к наличию двухцепочечной ДНК и позволяющий проводить ПЦР «в реальном времени» (количественную ПЦР) без добавления флюоресцентных зондов.
  • Не содержит UDG и dUTP.

Возможные приложения

ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с детекцией методом электрофореза, ПЦР с образцами кДНК после обратной транскрипции, генотипирование, ПЦР для проверки колоний, получение продукта для ТА-клонирования и др.

Совместимость с оборудованием

Совместима с амплификаторами любого типа.

Протокол

  1. Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 минуту, перемешайте содержимое пробирки и сбросьте капли центрифугированием. В дальнейшем восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течение 30 дней или заморозить и хранить при −20°С в пределах срока годности. Допускается до 5 раз замораживать/размораживать смесь после восстановления из лиофилизированной формы.
  2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
    ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в двух и более повторах для каждого образца ДНК.
  • Расчет на 1 реакцию объемом 25 мкл* с детекцией в режиме реального времени:
    Компонент Объем Примечание
    Реакционная смесь для ПЦР, 5x 5 мкл
    Прямой праймер 0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора Конечная концентрация 200–400 нМ
    Обратный праймер 0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакционной смеси 25 мкл* С учетом объема образца ДНК, который будет добавлен в п.4
    ДНК 2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК) Добавляется отдельно в каждую пробирку в п.4
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
  • Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл* с детекцией методом гель-электрофореза:
    Компонент Объем Примечание
    Реакционная смесь для ПЦР, 5x 5 мкл
    Прямой праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора Конечная концентрация 200–600 нМ
    Обратный праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
    ДНК 2–9 мкл
    (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)     		Добавляется отдельно в каждую пробирку в п.4
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
    *Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется к работе.
  1. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
  2. Внесите в каждую пробирку отдельным наконечником пипетки 2–9 мкл образца ДНК/кДНК (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК). После добавления ДНК суммарный объём реакции должен составить 25 мкл. Закройте крышки пробирок, сбросьте капли центрифугированием.
  3. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).
  • Если температура отжига праймеров ≥60°С
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40–50
    Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)     		60–72°С 30–60 с
  • Если температура отжига праймеров <60°С
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40–50
    Отжиг праймеров
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)    		 55–59°С 10–15 с
    Элонгация 72°С 15–30 с
    **Для детекции флуоресценции интеркалирующего красителя необходимо включить съёмку по каналу FAM.
  1. После проведения амплификации с детекцией результатов в режиме реального времени, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°С.
  2. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
  3. При необходимости продукты амплификации можно хранить при −20°С.

Условия хранения

  • Транспортировка: При температуре до +25°С — до 21 дня.
  • Хранение: при температуре не выше +4°С — 12 месяцев в пределах срока годности.
  • После восстановления в жидкую форму хранить при +4°С до 30 дней или заморозить и хранить при −20°С в пределах срока годности. Допускается не более 5 циклов замораживания/размораживания восстановленной смеси.
  • Срок годности: 12 месяцев с даты поставки, если иное не указано в паспорте товара.

Похожие товары