Амплификация ДНК с реакционной смесью для кПЦР ProbeMaster® Lyo ROX

ProbeMaster® Lyo ROX — лиофилизированная реакционная смесь, содержащая все необходимые компоненты для проведения количественной ПЦР с применением интеркалирующих красителей или гидролизуемых зондов. Eе состав оптимизирован для получения идеальных результатов с минимальным значением порогового цикла и высоким уровнем отношения сигнал/фон. Формат готовой реакционной смеси снижает риск контаминации образцов.

Реакционная смесь ProbeMaster® Lyo ROX позволяет решать большое количество задач с минимальными затратами времени. За счет присутствия референсного красителя ROX cмесь подходит для точного определения содержания ДНК матрицы в пробе и может применяться для количественного анализа и определения экспрессии генов, генотипирования, детекции SNP и других приложений.

Состав реакционной смеси:

  • HS Taq ДНК-полимераза;
  • смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов;
  • ПЦР-буфер (содержит Mg2+);
  • референсный краситель ROX;
  • протекторы для лиофилизации.

Ключевые характеристики смеси:

  • Одна пробирка лиофилизированной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
  • Смесь полностью готова к работе. Для постановки реакции в смесь необходимо добавить только образец ДНК, праймеры и воду, что значительно экономит время на постановку реакции. Формат готовой реакционной смеси также снижает риск контаминации образцов.
  • В качестве матрицы может использоваться геномная, вирусная, плазмидная ДНК, кДНК после обратной транскрипции и др.
  • Cодержит высокопроцессивную Hot-Start Taq-полимеразу с активацией 5 мин при 95°С. Используемая HS Taq ДНК-полимераза представляет собой комплекс моноклональных антител с ферментом. Прогрев образца в первом цикле ПЦР приводит к инактивации антител в составе комплекса и активирует фермент. Технология «горячего старта» позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
  • HS Taq ДНК-полимераза обладает 5′–3′ полимеразной, 5′–3′ экзонуклеазной активностью; также обладает трансферазной активностью, присоединяя дополнительный адениновый остаток к 3′ концам двуцепочечной ДНК, что позволяет использовать продукты ПЦР для ТА-клонирования.
  • Для нормировки сигнала в состав смеси входит референсный краситель ROX. Концентрация ROX специально оптимизирована для работы на большинстве real-time амплификаторов, доступных на рынке.
  • Смесь не содержит UDG и dUTP.

Возможные приложения:

ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с детекцией методом электрофореза, ПЦР с образцами кДНК после обратной транскрипции, генотипирование, ПЦР для проверки колоний.

Совместимость с оборудованием:

Совместим с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 мин, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. Восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течении 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 циклов замораживания/размораживания восстановленной смеси.

  1. Тщательно перемешайте содержимое пробирки, сбросьте капли центрифугированием.
  2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
    ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в двух и более повторах для каждого образца ДНК.
  • Расчет на1реакцию объемом 25 мкл* с детекцией в режиме реального времени:
    Компонент Объем Примечание
    Реакционная смесь для ПЦР, 5x 5 мкл
    Прямой праймер 0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора Конечная концентрация 200–400 нМ
    Обратный праймер 0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора
    Зонд
    или     		0,25–0,75 мкл 10 мкМ раствора 2,5–7,5 пмоль/реакцию
    (конечная концентрация 100–300 нМ)
    Интеркалирующий краситель Согласно рекомендации производителя
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакционной смеси 25 мкл* С учетом объема образца ДНК, который будет добавлен в п.4
    ДНК 2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК) Добавляется отдельно в каждую пробирку в п.4
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
    * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется к работе.
  1. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
  2. Внесите в каждую пробирку отдельным наконечником пипетки 2–9 мкл образца ДНК/кДНК (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК). После добавления ДНК суммарный объём реакции должен составить 25 мкл. Закройте крышки пробирок, сбросьте капли центрифугированием.
  1. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).
  • Если температура отжига праймеров ≥60°С
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40–50
    Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)     		60–72°С 30–60 с
  • Если температура отжига праймеров <60°С
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40–50
    Отжиг праймеров
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)    		 55–59°С 10–15 с
    Элонгация 72°С 15–30 с
    ** В настройках прибора выбрать канал ROX для пассивного референса.
  1. В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°С.
  2. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
  3. При необходимости продукты амплификации можно хранить при −20°С.

Условия хранения

  • 12 месяцев (с момента доставки) при температуре до +4°C. Транспортировка: до 21 суток при температуре до +25°С.
  • После восстановления в жидкую форму – хранить при +4°С до 30 суток или при −20°С в пределах срока годности. Продукт в жидкой форме не теряет функциональных свойств после 5 циклов заморозки-разморозки.
  • Срок годности: 12 месяцев с даты поставки, если иное не указано в паспорте товара.
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.