Амплификация ДНК с реакционной смесью для кПЦР ProbeMaster® Lyo ROX

ProbeMaster^® Lyo ROX — лиофилизированная реакционная смесь, содержащая все необходимые компоненты для проведения количественной ПЦР с применением интеркалирующих красителей или гидролизуемых зондов. Eе состав оптимизирован для получения идеальных результатов с минимальным значением порогового цикла и высоким уровнем отношения сигнал/фон. Формат готовой реакционной смеси снижает риск контаминации образцов.

Реакционная смесь ProbeMaster^® Lyo ROX позволяет решать большое количество задач с минимальными затратами времени. За счет присутствия референсного красителя ROX cмесь подходит для точного определения содержания ДНК матрицы в пробе и может применяться для количественного анализа и определения экспрессии генов, генотипирования, детекции SNP и других приложений.

Состав реакционной смеси:

• HS Taq ДНК-полимераза;
• смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов;
• ПЦР-буфер (содержит Mg²⁺);
• референсный краситель ROX;
• протекторы для лиофилизации.

Ключевые характеристики смеси:

• Одна пробирка лиофилизированной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
• Смесь полностью готова к работе. Для постановки реакции в смесь необходимо добавить только образец ДНК, праймеры и воду, что значительно экономит время на постановку реакции. Формат готовой реакционной смеси также снижает риск контаминации образцов.
• В качестве матрицы может использоваться геномная, вирусная, плазмидная ДНК, кДНК после обратной транскрипции и др.
• Cодержит высокопроцессивную Hot-Start Taq-полимеразу с активацией 5 мин при 95°С. Используемая HS Taq ДНК-полимераза представляет собой комплекс моноклональных антител с ферментом. Прогрев образца в первом цикле ПЦР приводит к инактивации антител в составе комплекса и активирует фермент. Технология «горячего старта» позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
• HS Taq ДНК-полимераза обладает 5′–3′ полимеразной, 5′–3′ экзонуклеазной активностью; также обладает трансферазной активностью, присоединяя дополнительный адениновый остаток к 3′ концам двуцепочечной ДНК, что позволяет использовать продукты ПЦР для ТА-клонирования.
• Для нормировки сигнала в состав смеси входит референсный краситель ROX. Концентрация ROX специально оптимизирована для работы на большинстве real-time амплификаторов, доступных на рынке.
• Смесь не содержит UDG и dUTP.

Возможные приложения:

ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с детекцией методом электрофореза, ПЦР с образцами кДНК после обратной транскрипции, генотипирование, ПЦР для проверки колоний.

Совместимость с оборудованием:

Совместим с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 мин, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. Восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течении 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 циклов замораживания/размораживания восстановленной смеси.

1. Тщательно перемешайте содержимое пробирки, сбросьте капли центрифугированием.
2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
   ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в двух и более повторах для каждого образца ДНК.

• Расчет на1реакцию объемом 25 мкл* с детекцией в режиме реального времени:

  Компонент	Объем	Примечание
  Реакционная смесь для ПЦР, 5x	5 мкл
  Прямой праймер	0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора	Конечная концентрация 200–400 нМ
  Обратный праймер	0,5–1,0 мкл 10 мкМ раствора
  Зонд или	0,25–0,75 мкл 10 мкМ раствора	2,5–7,5 пмоль/реакцию (конечная концентрация 100–300 нМ)
  Интеркалирующий краситель	Согласно рекомендации производителя
  Деионизованная вода	Добавляется до общего объема реакционной смеси 25 мкл*	С учетом объема образца ДНК, который будет добавлен в п.4
  ДНК	2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)	Добавляется отдельно в каждую пробирку в п.4
  Общий объём реакции	25 мкл*	При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций

  * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется к работе.

3. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
4. Внесите в каждую пробирку отдельным наконечником пипетки 2–9 мкл образца ДНК/кДНК (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК). После добавления ДНК суммарный объём реакции должен составить 25 мкл. Закройте крышки пробирок, сбросьте капли центрифугированием.

5. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).

• Если температура отжига праймеров ≥60°С

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
  Денатурация	95°С	10 с	40–50
  Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)	60–72°С	30–60 с

• Если температура отжига праймеров <60°С

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
  Денатурация	95°С	10 с	40–50
  Отжиг праймеров (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции**)	55–59°С	10–15 с
  Элонгация	72°С	15–30 с

  ** В настройках прибора выбрать канал ROX для пассивного референса.

6. В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°С.
7. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
8. При необходимости продукты амплификации можно хранить при −20°С.

Условия хранения

• Транспортировка: При температуре до +25°С — до 21 дня.
• Хранение: при температуре не выше +4°С — 12 месяцев в пределах срока годности.
• После восстановления в жидкую форму хранить при +4°С до 30 дней или заморозить и хранить при −20°С в пределах срока годности. Допускается не более 5 циклов замораживания/размораживания восстановленной смеси.
• Срок годности: 12 месяцев с даты поставки, если иное не указано в паспорте товара.