Амплификация ДНК с реакционной смесью для кПЦР ProbeMaster® Lyo UDG

ProbeMaster^®Lyo UDG — лиофилизированная реакционная смесь, включающая все необходимые компоненты для проведения ПЦР. Ее состав, содержащий Hot-start полимеразу, оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. Урацил-ДНК-гликозилаза в составе смеси исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов.

Смесь ProbeMaster^®Lyo UDG подходит как для проведения количественной ПЦР, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. В случае постановки реакции ПЦР в режиме реального времени, для детекции флуоресценции следует использовать ДНК-зонд, меченный флуорофором и тушителем (гидролизуемые зонды, «молекулярные маяки», праймеры типа «скорпион») или два зонда, меченных флуорофорами, образующими FRET-пару (вы можете заказать синтез зондов в Lumiprobe). Помимо ДНК-зондов, для детекции флуоресценции может использоваться интеркалирующий краситель dsGreen.

Одна пробирка лиофилизованной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.

Состав реакционной смеси

• HS Taq ДНК-полимераза;
• урацил-ДНК-гликозилаза (UDG);
• смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP);
• ПЦР-буфер (содержит Mg²⁺ с концентрацией 3 мМ в 1× реакционной смеси).
• Протекторы для лиофилизации.

Возможные приложения

Качественная и количественная ПЦР с детекцией продуктов амплификации как в режиме реального времени, так и с помощью гель-электрофореза, ПЦР после обратной транскрипции.

Для задач по клонированию и других применений, требующих дальнейшей работы с продуктом ПЦР после амплификации мы рекомендуем использовать наш продукт ProbeMaster^®Lyo UNI который не содержит dUTP.

Совместимость с оборудованием

Cовместима с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 минуту, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. В дальнейшем восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течение 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 раз замораживать/размораживать смесь после восстановления из лиофилизированной формы.

1. Разморозьте реакционную смесь при комнатной температуре, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
   ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в двух и более повторах для каждого образца ДНК.

• Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл* с детекцией в режиме реального времени:

  Компонент	Объем	Примечание
  5х Реакционная смесь PCR/qPCR с UDG	5 мкл
  Прямой праймер	0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора	5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ)
  Обратный праймер	0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора
  Зонд или	0.25–0.75 мкл 10 мкМ раствора	2.5–7.5 пмоль/реакцию (конечная концентрация 100–300 нМ)
  Интеркалирующий краситель	Согласно рекомендации производителя
  Деионизованная вода	Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
  ДНК	2–9 мкл (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)	Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
  Общий объём реакции	25 мкл*	При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций

• Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл* с детекцией методом гель-электрофореза:

  Компонент	Объем	Примечание
  5х Реакционная смесь PCR/qPCR c UDG	5 мкл
  Прямой праймер	0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора	5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ)
  Обратный праймер	0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора
  Деионизованная вода	Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
  ДНК	2–9 мкл (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)	Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
  Общий объём реакции	25 мкл*	При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций

  * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако проведение реакции в объеме меньше 10 мкл не рекомендуется.

3. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
4. Внесите образцы ДНК отдельно в каждую пробирку, закройте крышки пробирок, стрипов или заклейте планшет плёнкой, сбросьте капли центрифугированием.
5. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).

• Если температура отжига праймеров ≥60°C

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°C	5 мин	1
  Денатурация	95°C	10 с	40
  Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)	60–72°C	30–60 с

• Если температура отжига праймеров <60°C

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°C	5 мин	1
  Денатурация	95°C	10 с	40
  Отжиг праймеров (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)	55–59°C	10–15 с
  Элонгация	72°C	15–30 с

6. В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°C.
7. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
8. При необходимости храните продукты амплификации при −20°С.

Условия хранения

• Хранение: 12 месяцев (с момента доставки) при температуре до +4°C.
• Транспортировка: до 21 суток при температуре до +25°С.
• После восстановления в жидкую форму — хранить при +4°С до 30 суток или при −20°С в пределах срока годности. Продукт в жидкой форме не теряет функциональных свойств после 5 циклов заморозки-разморозки.