Амплификация ДНК с реакционной смесью для кПЦР ProbeMaster® Lyo UDG

ProbeMaster®Lyo UDG — лиофилизированная реакционная смесь, включающая все необходимые компоненты для проведения ПЦР. Ее состав, содержащий Hot-start полимеразу, оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. Урацил-ДНК-гликозилаза в составе смеси исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов.

Смесь ProbeMaster®Lyo UDG подходит как для проведения количественной ПЦР, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. В случае постановки реакции ПЦР в режиме реального времени, для детекции флуоресценции следует использовать ДНК-зонд, меченный флуорофором и тушителем (гидролизуемые зонды, «молекулярные маяки», праймеры типа «скорпион») или два зонда, меченных флуорофорами, образующими FRET-пару (вы можете заказать синтез зондов в Lumiprobe). Помимо ДНК-зондов, для детекции флуоресценции может использоваться интеркалирующий краситель dsGreen.

Одна пробирка лиофилизованной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.

Состав реакционной смеси

  • HS Taq ДНК-полимераза;
  • урацил-ДНК-гликозилаза (UDG);
  • смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP);
  • ПЦР-буфер (содержит Mg2+ с концентрацией 3 мМ в 1× реакционной смеси).
  • Протекторы для лиофилизации.

Возможные приложения

Качественная и количественная ПЦР с детекцией продуктов амплификации как в режиме реального времени, так и с помощью гель-электрофореза, ПЦР после обратной транскрипции.

Для задач по клонированию и других применений, требующих дальнейшей работы с продуктом ПЦР после амплификации мы рекомендуем использовать наш продукт ProbeMaster®Lyo UNI который не содержит dUTP.

Совместимость с оборудованием

Cовместима с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 минуту, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. В дальнейшем восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течение 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 раз замораживать/размораживать смесь после восстановления из лиофилизированной формы.

  1. Разморозьте реакционную смесь при комнатной температуре, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
  2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
    ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в двух и более повторах для каждого образца ДНК.
  • Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл* с детекцией в режиме реального времени:
    Компонент Объем Примечание
    5х Реакционная смесь PCR/qPCR с UDG 5 мкл
    Прямой праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию
    (конечная концентрация 200–600 нМ)
    Обратный праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора
    Зонд
    или    		 0.25–0.75 мкл 10 мкМ раствора 2.5–7.5 пмоль/реакцию
    (конечная концентрация 100–300 нМ)
    Интеркалирующий краситель Согласно рекомендации производителя
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
    ДНК 2–9 мкл
    (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)     		Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
  • Расчет на 1 реакцию ПЦР объемом 25 мкл* с детекцией методом гель-электрофореза:
    Компонент Объем Примечание
    5х Реакционная смесь PCR/qPCR c UDG 5 мкл
    Прямой праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ)
    Обратный праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
    ДНК 2–9 мкл
    (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)     		Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
    * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако проведение реакции в объеме меньше 10 мкл не рекомендуется.
  1. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
  2. Внесите образцы ДНК отдельно в каждую пробирку, закройте крышки пробирок, стрипов или заклейте планшет плёнкой, сбросьте капли центрифугированием.
  3. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).
  • Если температура отжига праймеров ≥60°C
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°C 5 мин 1
    Денатурация 95°C 10 с 40
    Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)     		60–72°C 30–60 с
  • Если температура отжига праймеров <60°C
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°C 5 мин 1
    Денатурация 95°C 10 с 40
    Отжиг праймеров
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)    		 55–59°C 10–15 с
    Элонгация 72°C 15–30 с
  1. В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95°C.
  2. Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
  3. При необходимости храните продукты амплификации при −20°С.

Условия хранения

  • Хранение: 12 месяцев (с момента доставки) при температуре до +4°C.
  • Транспортировка: до 21 суток при температуре до +25°С.
  • После восстановления в жидкую форму — хранить при +4°С до 30 суток или при −20°С в пределах срока годности. Продукт в жидкой форме не теряет функциональных свойств после 5 циклов заморозки-разморозки.

Похожие товары

ProbeMaster® Lyo UDG, 5× реакционная смесь

Лиофилизированная готовая реакционная смесь, содержащая UDG и dUTP, для проведения количественной ПЦР.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
L0514 100 rxn
$119.00
 20 д
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.