Определение концентрации двухцепочечной ДНК с помощью красителя PreciseGreen®

Краситель PreciseGreen для определения концентрации ДНК представляет собой высокочувствительный реагент для определения низких концентраций двухцепочечной ДНК (не определяемых спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм). Благодаря селективному связыванию красителя с двухцепочечной ДНК на результаты измерения не оказывают влияния одноцепочечная ДНК, РНК, нуклеотиды, белки и другие присутствующие в пробе примеси.

Линейный диапазон измерения концентрации ДНК с помощью красителя PreciseGreen составляет от 1 пг/мкл до 5 нг/мкл. Краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм (для проведения измерений подойдет любой тип флуориметра). Для большей точности и воспроизводимости данных рекомендуется разводить образцы ДНК и краситель PreciseGreen в TE буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ EDTA). Для расчёта концентрации исследуемой ДНК необходимо построить калибровочную кривую, используя серию разведений стандартного раствора ДНК.

Буфер, стандартный раствор ДНК и краситель PreciseGreen входят в состав набора PreciseGreen для определения количества дцДНК. Краситель PreciseGreen также доступен для заказа отдельно. Раствора красителя объемом 1 мл достаточно для проведения 200 измерений при работе с объемом измеряемого образца 2 мл (минимально необходимый объём образца для измерений в стандартной флуориметрической кювете объёмом 3.5 мл). Количество измерений может варьироваться в зависимости от объема образца. Рекомендуемые объёмы образца для наиболее популярного флуориметрического оборудования представлены ниже в таблице.

Протокол

1. Приготовление рабочего раствора PreciseGreen

Разморозьте и тщательно перемешайте содержимое пробирки с красителем. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора красителя для всех образцов (исследуемые образцы и стандартные растворы ДНК): объём рабочего раствора красителя должен составить 50% от общего объёма измеряемого образца (уточните в таблице ниже рекомендуемый объём образца для используемого оборудования). Разведите необходимое количество красителя PreciseGreen в 200 раз буфером (мы рекомендуем использовать TE буфер: 10 мМ Тris HCl, 1 мМ EDTA, pH 7.5). Перемешайте. Раствор пригоден для использования в течение 3 часов.

! Чтобы нивелировать возможные ошибки дозирования, мы рекомендуем приготовить рабочий раствор красителя с запасом 10-25%. Для расчета необходимого объёма рабочего раствора красителя Вы можете воспользоваться следующей формулой:

V_PreciseGreen = 5/8 × V_{образца} × (N_{образцов}+ N_{стандартов}), где V_{образца} — измеряемый объем исследуемого образца или стандарта, N_{образцов} — количество измеряемых образцов, и N_{стандартов} — количество измеряемых стандартов (включая образец с нулевой концентрацией ДНК).

2. Приготовление образцов

Разведите исследуемый образец ДНК в буфере таким образом, чтобы объём образца составил 50% измеряемого объема (исходный объём образца может быть любым, однако конечное разведение должно соответствовать диапазону 1 пг/мкл — 5 нг/мкл). Добавьте равный объем рабочего раствора красителя PreciseGreen. Перемешайте и инкубируйте 5 минут.

Аналогичным образом приготовьте разведения стандартного раствора ДНК. Обратите внимание, что разведения стандартного раствора ДНК должны находиться в диапазоне концентраций экспериментальных образцов и быть приготовлены таким образом, чтобы соответствовать линейному диапазону измерений вашего оборудования. Готовый стандартный раствор ДНК доступен только в составе набора. При заказе красителя PreciseGreen отдельно (не в составе набора), поставка стандартного раствора ДНК не предусмотрена.

Рекомендуемые объёмы для измерения концентрации ДНК с помощью красителя PreciseGreen:

* Для обеспечения точности измерений рекомендуется избегать дозирования объёмов менее 2 мкл.

3. Измерение флуоресценции

Измерьте интенсивность флуоресценции стандартных растворов ДНК и экспериментальных образцов ДНК (краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм).

4. Расчет концентрации ДНК

Постройте калибровочную кривую, используя данные об уровне флуоресценции стандартных растворов. Аппроксимируйте данные линейной функцией, найдите параметры функции A и B. Линейное уравнение зависимости флуоресценции (FL) от концентрации C  выглядит следующим образом:

FL= A × C + B, где FL — интенсивность флуоресценции в условных единицах, а C — концентрация ДНК, A и B — параметры линейной функции.

Концентрация ДНК в экспериментальном образце:

C_{образца} = (FL_{образца} — B)/A, где FL_{образца} — флуоресценция образца, A и B — параметры найденной линейной функции.

Концентрация ДНК в исходном образце:

С_исх = V_{образца} × C_{образца}/V_исх, где V_{образца} — объём образца и V_исх — объем исходного раствора ДНК, использованный для приготовления экспериментального образца.

Для проведения необходимых вычислений Вы также можете воспользоваться нашими калькуляторами: для расчета концентрации ДНК и приготовления/разбавления растворов.

Пример уравнения зависимости флуоресценции от концентрации ДНК:

Похожие товары

Краситель PreciseGreen для определения концентрации дцДНК, 200×

PreciseGreen - краситель для точного определения концентрации двухцепочечной ДНК в присутствии РНК, одноцепочечной ДНК и других примесей. Этот краситель в присутствии дцДНК начинает ярко флуоресцировать в канале FAM. Флуоресцентный сигнал прямо пропорционален концентрации ДНК в образце в диапазоне от десятков пг/мл до сотен нг/мл.

Показать цены

Спрятать цены

×

Ваше сообщение успешно отправлено.

×

Извините, ваш запрос не может быть обработан. Попробуйте выполнить его позже.

×

Имя*:

E-mail*:

Сообщение*:

Отправить сообщение

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки	Купить товар
12010	100 uL	$46	в наличии (от 10 шт.)	В корзину (от 10)
42010	1 mL	$360	в наличии	В корзину
52010	10 mL	$2350	20 д	В корзину
62010	25 mL	по запросу	в наличии	Запросить цену

Оптовый заказ

Количество *

Имя *

Компания *

Телефон

email *

Комментарий

Отправить запрос

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

---

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ

Введено некорректное число товаров для добавления.