Определение концентрации двухцепочечной ДНК с помощью красителя PreciseGreen

Краситель PreciseGreen для определения концентрации ДНК представляет собой высокочувствительный реагент для определения низких концентраций двухцепочечной ДНК (не определяемых спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм). Благодаря селективному связыванию красителя с двухцепочечной ДНК на результаты измерения не оказывают влияния одноцепочечная ДНК, РНК, нуклеотиды, белки и другие присутствующие в пробе примеси.

Линейный диапазон измерения концентрации ДНК с помощью красителя PreciseGreen составляет от 1 пг/мкл до 5 нг/мкл. Краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм (для проведения измерений подойдет любой тип флуориметра). Для большей точности и воспроизводимости данных рекомендуется разводить образцы ДНК и краситель PreciseGreen в TE буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ EDTA). Для расчёта концентрации исследуемой ДНК необходимо построить калибровочную кривую, используя серию разведений стандартного раствора ДНК.

Буфер, стандартный раствор ДНК и краситель PreciseGreen входят в состав набора PreciseGreen для определения количества дцДНК. Краситель PreciseGreen также доступен для заказа отдельно. Раствора красителя объемом 1 мл достаточно для проведения 200 измерений при работе с объемом измеряемого образца 2 мл (минимально необходимый объём образца для измерений в стандартной флуориметрической кювете объёмом 3.5 мл). Количество измерений может варьироваться в зависимости от объема образца. Рекомендуемые объёмы образца для наиболее популярного флуориметрического оборудования представлены ниже в таблице.

Протокол

1. Приготовление рабочего раствора PreciseGreen

Разморозьте и тщательно перемешайте содержимое пробирки с красителем. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора красителя для всех образцов (исследуемые образцы и стандартные растворы ДНК): объём рабочего раствора красителя должен составить 50% от общего объёма измеряемого образца (уточните в таблице ниже рекомендуемый объём образца для используемого оборудования). Разведите необходимое количество красителя PreciseGreen в 200 раз буфером (мы рекомендуем использовать TE буфер: 10 мМ Тris HCl, 1 мМ EDTA, pH 7.5). Перемешайте. Раствор пригоден для использования в течение 3 часов.

! Чтобы нивелировать возможные ошибки дозирования, мы рекомендуем приготовить рабочий раствор красителя с запасом 10-25%. Для расчета необходимого объёма рабочего раствора красителя Вы можете воспользоваться следующей формулой:

V_PreciseGreen = 5/8 × V_{образца} × (N_{образцов}+ N_{стандартов}), где V_{образца} — измеряемый объем исследуемого образца или стандарта, N_{образцов} — количество измеряемых образцов, и N_{стандартов} — количество измеряемых стандартов (включая образец с нулевой концентрацией ДНК).

2. Приготовление образцов

Разведите исследуемый образец ДНК в буфере таким образом, чтобы объём образца составил 50% измеряемого объема (исходный объём образца может быть любым, однако конечное разведение должно соответствовать диапазону 1 пг/мкл — 5 нг/мкл). Добавьте равный объем рабочего раствора красителя PreciseGreen. Перемешайте и инкубируйте 5 минут.

Аналогичным образом приготовьте разведения стандартного раствора ДНК. Обратите внимание, что разведения стандартного раствора ДНК должны находиться в диапазоне концентраций экспериментальных образцов и быть приготовлены таким образом, чтобы соответствовать линейному диапазону измерений вашего оборудования. Готовый стандартный раствор ДНК доступен только в составе набора. При заказе красителя PreciseGreen отдельно (не в составе набора), поставка стандартного раствора ДНК не предусмотрена.

Рекомендуемые объёмы для измерения концентрации ДНК с помощью красителя PreciseGreen:

* Для обеспечения точности измерений рекомендуется избегать дозирования объёмов менее 2 мкл.

3. Измерение флуоресценции

Измерьте интенсивность флуоресценции стандартных растворов ДНК и экспериментальных образцов ДНК (краситель, cвязанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм).

4. Расчет концентрации ДНК

Постройте калибровочную кривую, используя данные об уровне флуоресценции стандартных растворов. Аппроксимируйте данные линейной функцией, найдите параметры функции A и B. Линейное уравнение зависимости флуоресценции (FL) от концентрации C  выглядит следующим образом:

FL= A × C + B, где FL — интенсивность флуоресценции в условных единицах, а C — концентрация ДНК, A и B — параметры линейной функции.

Концентрация ДНК в экспериментальном образце:

C_{образца} = (FL_{образца} — B)/A, где FL_{образца} — флуоресценция образца, A и B — параметры найденной линейной функции.

Концентрация ДНК в исходном образце:

С_исх = V_{образца} × C_{образца}/V_исх, где V_{образца} — объём образца и V_исх — объем исходного раствора ДНК, использованный для приготовления экспериментального образца.

Для проведения необходимых вычислений Вы также можете воспользоваться нашими калькуляторами: для расчета концентрации ДНК и приготовления/разбавления растворов.

Пример уравнения зависимости флуоресценции от концентрации ДНК:

Похожие товары

Краситель PreciseGreen для определения концентрации дцДНК, 200×

PreciseGreen - краситель для точного определения концентрации двухцепочечной ДНК в присутствии РНК, одноцепочечной ДНК и других примесей. Этот краситель в присутствии дцДНК начинает ярко флуоресцировать в канале FAM. Флуоресцентный сигнал прямо пропорционален концентрации ДНК в образце в диапазоне от десятков пг/мл до сотен нг/мл.

Показать цены

Спрятать цены

×

Ваше сообщение успешно отправлено.

×

Извините, ваш запрос не может быть обработан. Попробуйте выполнить его позже.

×

Имя*:

E-mail*:

Сообщение*:

Отправить сообщение

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки	Купить товар
12010	100 uL	–	в наличии	Запросить образец
42010	1 mL	$360	в наличии	В корзину
62010	25 mL	по запросу	в наличии	Запросить цену

Оптовый заказ

Количество *

Имя *

Компания *

Телефон

email *

Комментарий

Отправить запрос

Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

---

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ

Введено некорректное число товаров для добавления.