Визуализация внутриклеточного кальция с помощью красителей Fluo-4 AM и FluoriCa-8 AM

Fluo-4 AM и FluoriCa-8 AM — флуоресцентные индикаторы кальция в форме ацетоксиметиловых (AM) эфиров, способные проникать сквозь клеточные мембраны. После проникновения в живые клетки AM-группы расщепляются внутриклеточными эстеразами, в результате чего образуются флуоресцентные красители, непроникающие сквозь мембраны и удерживающиеся в цитоплазме. При связывании со свободными внутриклеточными ионами Ca²⁺ их зеленая флуоресценция значительно усиливается. Это позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения концентрации внутриклеточного кальция с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или планшетных флуоресцентных ридеров.

Перед началом работы

• Оптимальную концентрацию красителя и время инкубации следует определять эмпирически для каждого типа клеток.
• Fluo-4 AM и FluoriCa-8 AM не связываются ковалентно с клеточными компонентами и могут активно выводиться из клетки транспортерами органических анионов. Поэтому визуализацию живых клеток необходимо проводить в течение одного или двух часов после загрузки индикатора.
• При необходимости индикаторы можно повторно загрузить в клетки.
• Fluo-4 AM и FluoriCa-8 AM также могут быть зафиксированы in situ с использованием EDC/EDAC для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания.

Приготовление стокового раствора

• Приготовьте стоковый раствор концентрацией 1–5 мМ, растворив Fluo-4 AM или FluoriCa-8 AM в DMSO для мечения.
• Разделите стоковый раствор на аликвоты и храните при −20°C, защищая от света. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

Приготовление загрузочного раствора

• Приготовьте рабочий раствор концентрацией 1–20 мкМ в HHBS или другом физиологическом буфере. Оптимальную концентрацию красителя необходимо определять эмпирически для каждого типа клеток. Для большинства клеток млекопитающих конечная концентрация красителя 1–5 мкМ позволяет получать оптимальные загрузку и интенсивность сигнала. Используйте минимальную концентрацию красителя, обеспечивающую флуоресценцию с достаточным отношением сигнал/шум.
• Во время загрузки используйте среду без сыворотки: сыворотка содержит эстеразы, которые могут гидролизовать AM-эфир до проникновения красителя в клетки.
• Для улучшения растворимости красителя и загрузки в клетки рекомендуется добавление 0,02% Pluronic F-127 в загрузочный раствор.
• Если утечка красителя является проблемой, добавьте в буфер для загрузки ингибиторы транспорта органических анионов Probenecid (0,5–1 мМ) или Sulfinpyrazone (0,1–0,25 мМ).
  Важно: ингибиторы транспорта органических анионов могут быть токсичными для клеток и изменять функциональные свойства клеток путем ингибирования одних анионных транспортеров и активации других. Стоковые растворы Sulfinpyrazone и Probenecid имеют щелочную реакцию; после их добавления необходимо скорректировать pH среды загрузочного раствора.

Загрузка красителя в клетки

1. Высейте клетки и культивируйте до достижения необходимой конфлюэнтности.
2. Если исследуемые соединения несовместимы с сывороткой, замените культуральную среду на HHBS или другой буфер перед загрузкой красителя.
3. Замените среду/буфер достаточным количеством загрузочного раствора Fluo-4 AM или FluoriCa-8 AM. Для адгезионных клеток убедитесь, что раствор красителя полностью покрывает клеточный монослой. Для суспензионных клеток поддерживайте мягкое перемешивание.
4. Инкубируйте клетки при комнатной температуре или при 37°C в течение 15–60 минут в темноте. Некоторые типы клеток дают более сильную флуоресценцию после 2-часовой инкубации. Понижение температуры инкубации уменьшает субклеточную компартментализацию красителя (характерная проблема загрузки AM-эфиров).
5. После загрузки замените раствор красителя свежим HHBS или буфером для визуализации для удаления внеклеточного красителя и завершения деэтерификации.
6. Инкубируйте в течение 30 минут в свежем буфере при 37°C в темноте для обеспечения полного гидролиза AM-эфира.
7. Замените буфер на свежий, содержащий Ca²⁺ (обычно 1–2 мМ), либо на буфер без Ca²⁺ (если исследуются условия без Ca²⁺).
8. (Опционально). При необходимости поддерживайте концентрацию 0,5–1 мМ Probenecid или 0,1–0,25 мМ Sulfinpyrazone в буфере для визуализации на протяжении всего эксперимента для минимизации утечки красителя.

Измерение флуоресценции

1. Используйте флуоресцентный микроскоп или планшетный ридер с возбуждением при 488 нм и регистрацией эмиссии при 520 нм (или стандартный канал FITC). Получите time-lapse последовательности флуоресцентных изображений, используя постоянные параметры съемки.
2. Выделите области интереса (ROI), соответствующие отдельным клеткам, и измерьте среднюю интенсивность флуоресценции для каждой ROI в каждый момент времени.
3. Измерьте интенсивность флуоресценции в области изображения, не содержащей клеток, и вычтите этот фоновый сигнал из соответствующих значений клеточной флуоресценции.
4. Определите базовую флуоресценцию (F₀), усреднив интенсивность флуоресценции каждой клетки в период до стимуляции.
5. Рассчитайте относительное изменение флуоресценции для каждой временной точки с использованием следующего уравнения:
   
   где F — скорректированная на фон интенсивность флуоресценции в каждый момент времени, а F₀ — средняя базовая флуоресценция до стимуляции.
6. Постройте график ΔF/F₀ как функцию времени для визуализации динамики внутриклеточного Ca²⁺.

Проблемы и их устранение