Fluo-4 AM, зеленый флуоресцентный кальциевый индикатор

Fluo-4 AM — проникающий в живые клетки кальциевый индикатор. Краситель метаболизируется внутриклеточными эстеразами, после чего он способен связываться с Ca²⁺, что приводит к появлению ярко-зеленого флуоресцентного сигнала (λ возбуждения/испускания — 494/506 нм). Fluo-4 AM используется для детекции внутриклеточного Ca²⁺. Он прекрасно подходит для различных задач флуорометрии и имиджинга, таких как микроскопия, проточная цитометрия, спектрофлуориметрия и флуорометрический высокопроизводительный скрининг на микропланшетах ^[1].

Fluo-4 AM похож по структуре и спектральным свойствам на широко используемый Ca²⁺-индикатор Fluo-3, но обладает рядом преимуществ перед ним, таких как более яркая флуоресценция, высокая скорость проникновения в клетку и K_d для Ca²⁺ около 345 нМ. Благодаря более высокой интенсивности флуоресценции, Fluo-4 AM можно использовать при более низких внутриклеточных концентрациях, что делает его использование менее токсичным для живых клеток.

Поскольку Fluo-4 AM не связывается ковалентно с клеточными компонентами, он может активно выводиться из клетки органическими переносчиками анионов, поэтому визуализация клеток in vivo с помощью Fluo-4 AM обычно выполняется в течение одного или двух часов после добавления красителя. При этом, краситель может быть повторно загружен в клетки, если это необходимо. Для определения локализации красителя в клетке, Fluo-4 AM можно фиксировать in situ с помощью EDC/EDAC и докрасить иммунохимически с использованием anti-BAPTA антител ^[2].

Fluo-4 AM имеет низкую растворимость в воде. Перед добавления к клеткам рекомендуется приготовить стоковый 1 мМ раствор красителя в ДМСО для мечения. Используйте конечную концентрацию 1–5 мкМ и инкубацию при 37°C в течение 15–60 мин в качестве отправной точки вашего протокола.