Оценка пролиферации и жизнеспособности клеток с помощью Cell Counting Kit 8 (CCK-8)

Cell Counting Kit 8 (CCK-8) — высокочувствительный колориметрический метод, применяемый для определения жизнеспособности клеток, их пролиферации и цитотоксичности.

Принцип работы основан на использовании водорастворимой тетразольной соли WST-8. В живых клетках эта соль восстанавливается внутриклеточными дегидрогеназами до водорастворимого формазанового красителя оранжевого цвета. Интенсивность окраски, измеряемая с помощью ридера для микропланшетов при определенной длине волны (около 450 нм), прямо пропорциональна количеству метаболически активных клеток.

Метод CCK-8 прост в использовании и обладает меньшей токсичностью и большей чувствительностью, чем тесты на основе других солей тетразолия, такие как MTT, XTT, MTS или WST-1.

Определение числа клеток

Перед началом экспериментов с количественным определением абсолютного числа необходимо построить стандартную кривую, коррелирующую оптическую плотность (ОП) с числом клеток в постоянных экспериментальных условиях.

  1. Подсчитайте число клеток в суспензии с помощью цитометра. Посейте клетки в 96-луночный планшет с рассчитанной плотностью.
  2. Последовательно разбавляйте клеточную суспензию в культуральной среде для создания градиента концентраций клеток. Рекомендуется использовать минимум 3–5 различных концентраций; каждую реплицировать в 3–6 лунках.
  3. Культивируйте клетки до их адгезии к стенкам. Затем добавьте реагент CCK-8 в каждую лунку и инкубируйте в течение заданного времени.
  4. Измерьте поглощение при 450 нм.
  5. Постройте стандартную кривую, откладывая среднее значение ОП (ось Y) в зависимости от соответствующего известного числа посеянных клеток (ось X). Эта кривая позволяет определить количество клеток в неизвестном образце, культивируемом в идентичных экспериментальных условиях.

Анализ жизнеспособности клеток

  1. Посейте суспензию клеток (100 мкл/лунку) в 96-луночный планшет.
  2. Инкубируйте планшет в течение 24 часов в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂.
  3. Добавьте по 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку, избегая попадания пузырьков воздуха, так как они могут повлиять на показания поглощения.
  4. Инкубируйте планшет дополнительно 2 часа.
  5. Измерьте поглощение при длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера.
  6. (Опционально) Если измерения невозможно провести немедленно, реакцию можно стабилизировать, добавив в каждую лунку по 10 мкл 0,1 М HCl или 1% (вес/объём) раствора SDS. Затем планшет следует накрыть и хранить в темноте при комнатной температуре. Значения поглощения в этих условиях остаются стабильными до 24 часов.

Анализ пролиферации клеток и цитотоксичности

  1. Посейте суспензию клеток (100 мкл на лунку) в 96-луночный планшет.
  2. Инкубируйте планшет в течение 24 часов в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂.
  3. Добавьте по 10 мкл исследуемого соединения в различных концентрациях в соответствующие лунки.
  4. Инкубируйте клетки в планшете в течение необходимого времени.
  5. Добавьте по 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку, избегая образования пузырьков.
  6. (Опционально) Если исследуемое соединение обладает собственными окислительными или восстановительными свойствами, перед добавлением CCK-8 следует заменить питательную среду на свежую, без лекарственного препарата, чтобы избежать артефактов. Для этого аспирируйте старую среду, дважды промойте лунки PBS или свежей средой, а затем добавьте 100 мкл новой среды перед добавлением CCK-8.
  7. Инкубируйте планшет в течение 2 часов и измерьте поглощение при длине волны 450 нм.
  8. (Опционально) Если поглощение невозможно измерить немедленно, реакцию можно стабилизировать, добавив в каждую лунку по 10 мкл 0,1 М HCl или 1% (вес/объем) раствора SDS. Затем планшет следует накрыть и хранить в темноте при комнатной температуре. Значения поглощения остаются стабильными до 24 часов в этих условиях.

Расчет жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток выражается в процентах и рассчитывается по следующей формуле:

Жизнеспособность клеток (%) = [A (обработанных) − A (пустых)] / [A (необработанных) − A (пустых)] × 100

Где:

  • A (обработанных) — это поглощение в лунке, содержащей клетки, CCK-8 и тестируемое соединение.
  • A (пустых) — это поглощение в лунке, содержащей только среду и CCK-8 (без клеток).
  • A (необработанных) — это поглощение в лунке, содержащей только клетки и CCK-8 (без тестируемого соединения).

Данный расчет дает значение, отражающее либо пролиферативную активность клеток, либо цитотоксическую жизнеспособность.

Примечания и технические рекомендации

  • Анализ методом CCK-8 основан на реакции восстановления, катализируемой ферментом дегидрогеназой. Поэтому восстановители и антиоксиданты, присутствующие в образце, могут искажать результаты и должны быть удалены перед анализом.
  • Настоятельно рекомендуется провести предварительные эксперименты для оптимизации ключевых параметров, таких как плотность посева клеток и время инкубации после добавления к клеткам реагента CCK-8.
  • Лейкоцитам и другим неадгезивным типам клеток может потребоваться более длительное время культивирования для получения адекватного сигнала.
  • Для адгезивных клеток в стандартном 96-луночном планшете рекомендуется минимальная плотность посева 1000 клеток на лунку в 100 мкл среды. В связи с меньшей чувствительностью метода при анализе лейкоцитов плотность посева должна быть минимум 2500 клеток на лунку.
  • При использовании планшетов разных форматов (например, 24-луночных или 6-луночных) пропорционально масштабируйте количество клеток и объем реагента CCK-8, сохраняя объем CCK-8 на уровне 10% от общего объема среды в лунке.
  • Хотя оптимальный максимум поглощения WST-8 составляет 450 нм, допустимы фильтры в диапазоне 430–490 нм, хотя и с пониженной чувствительностью.
  • Фоновое поглощение, вносимое феноловым красным в питательную среду, автоматически учитывается и вычитается на этапе расчета с помощью контрольных пустых лунок.
  • Наличие пузырьков воздуха в лунках значительно искажает результаты измерений поглощения, поэтому они должны быть удалены перед считыванием данных с планшета.
  • Используйте стандартные средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки, перчатки, и лабораторный халат, во время всей процедуры анализа.

Условия хранения:

  • Хранение при 0–5°C. Транспортировка: до 21 дня при температуре до 25°С.
  • CCK-8 стабилен в течение одного года при температуре 0–5°C в защищенном от света месте.
  • Для более длительного хранения можно заморозить и хранить при температуре −20°C.
  • Избегайте повторного размораживания и замораживания, поскольку это приводит к увеличению фонового уровня, что мешает результатам анализа.
  • Срок годности: 12 месяцев с даты поставки.

Похожие товары

CCK-8, тест для анализа пролиферации клеток

Высокочувствительный колориметрический тест для определения жизнеспособности клеток, их пролиферации и цитотоксичности.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
11972
/ 100 тестов
100 uL
$12
 21 д
31972
/ 500 тестов
5 mL
$138
 21 д
41972
/ 1000 тестов
10 mL
$269
 21 д
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.