Мечение и долгосрочное отслеживание живых клеток с помощью красителей CytoTracer®

Красители CytoTracer® представляют собой проникающие в живые клетки флуоресцентные зонды, предназначенные для мечения и долгосрочного отслеживания живых клеток. После проникновения через плазматическую мембрану они превращаются в непроникающие сквозь мембраны тиолреактивные соединения, которые ковалентно связываются с внутриклеточными белками. Благодаря этому данные красители надежно удерживаются внутри клеток, передаются их потомкам при делении, но не переносятся в соседние клетки. При рекомендуемых рабочих концентрациях красители практически не оказывают цитотоксического действия в течение как минимум 72 часов.

Красители CytoTracer® различаются спектральными характеристиками. CMFDA и CMRA становятся флуоресцентными после гидролиза внутриклеточными эстеразами, тогда как CMAC, CMHC, BMQC, CM-BDP® и CMTPX обладают собственной флуоресценцией.

Перед началом работы

  • Не используйте буферы, содержащие амины (например, Tris, глицин) или тиолы (например, β-меркаптоэтанол, DTT), поскольку они снижают эффективность мечения.
  • Оптимальная рабочая концентрация зависит от типа клеток и продолжительности эксперимента:
    • 5–25 мкМ — для долгосрочных экспериментов (>3 суток) и быстро делящихся клеток;
    • 0,5–5 мкМ — для кратковременных экспериментов.
  • Используйте минимальную эффективную концентрацию красителя.
  • При длительных экспериментах (>72 часов) интенсивность флуоресценции постепенно снижается вследствие деления клеток. При необходимости выполните повторное окрашивание.
  • Красители совместимы с фиксацией 4% параформальдегидом (PFA), но не подходят для фиксации метанолом или ацетоном, которые вызывают вымывание красителя. После фиксации клетки можно пермеабилизовать мягкими детергентами для последующего иммуноокрашивания. Интенсивность флуоресценции может уменьшиться примерно на 20–30%.
  • При работе с фиксированными образцами рекомендуется использовать antifade-заключающие среды. Во время визуализации живых клеток используйте минимальные интенсивность возбуждения и время экспозиции для снижения фототоксичности и фотообесцвечивания.

Приготовление стоковых растворов

  1. Перед вскрытием доведите флакон с красителем до комнатной температуры.
  2. Растворите содержимое флакона в безводном ДМСО до концентрации 10 мМ.

Приготовление рабочих растворов

  1. Разведите стоковый раствор в бессывороточной культуральной среде до конечной концентрации 1–10 мкМ (или другой, подобранной экспериментально).
  2. Перед использованием прогрейте рабочий раствор до 37°C.

Важно! Во время окрашивания используйте только бессывороточную среду, поскольку белки сыворотки связывают краситель и уменьшают его проникновение в клетки. После завершения окрашивания клетки можно перевести в полную культуральную среду.

Окрашивание суспензионных клеток

  1. Осадите клетки центрифугированием (5 минут при 200–300 × g) и удалите супернатант.
  2. Ресуспендируйте клетки в предварительно прогретом рабочем растворе CytoTracer® в концентрации 1–5 × 10⁶ клеток/мл.
  3. Инкубируйте клетки 15–45 минут при 37°C и 5% CO₂. В большинстве случаев рекомендуется начинать с 30 минут.
  4. Осадите клетки центрифугированием и удалите раствор красителя.
  5. При необходимости однократно промойте клетки полной культуральной средой.
  6. Ресуспендируйте клетки в свежей полной среде и перенесите в культуральные сосуды или на предметные стекла.
  7. Выполните визуализацию с использованием соответствующего набора фильтров.

Окрашивание адгезионных клеток

  1. Вырастите клетки на покровных стеклах или в культуральной посуде.
  2. Замените культуральную среду предварительно прогретым рабочим раствором CytoTracer® (объем должен полностью покрывать покровные стекла).
  3. Инкубируйте клетки 15–45 минут при 37°C.
  4. Удалите раствор красителя и дважды промойте клетки свежей культуральной средой.
  5. Добавьте полную культуральную среду и инкубируйте клетки не менее 30 минут. Для красителей CMFDA и CMRA этот этап необходим для завершения гидролиза эстеразами и образования флуоресцентного продукта.
  6. После этого клетки готовы к микроскопии или дальнейшему культивированию.

Спектральные характеристики

Кат. № Краситель λEx, нм λEm, нм Канал
4682-x CMAC 345 465 Синий
4699-x CM-BDP® 514 542 Зеленый
4276-x CMTMR 540 565 Оранжевый

Проблемы и их устранение

Проблема Возможная причина Решение
Слабая или отсутствующая флуоресценция Недостаточное накопление красителя; неполный гидролиз эстеразами (для CMFDA/CMRA) Увеличьте концентрацию красителя или время инкубации; убедитесь, что инкубация проходит при 37°C; выдержите не менее 30 минут после окрашивания перед визуализацией.
Высокий фон или внеклеточное окрашивание Недостаточная промывка; образование агрегатов красителя После окрашивания выполните промывку средой с сывороткой; используйте свежеприготовленный рабочий раствор.
Цитотоксичность или изменение морфологии клеток Слишком высокая концентрация красителя Подберите меньшую концентрацию; используйте минимальную эффективную концентрацию; оцените жизнеспособность клеток (например, с помощью трипанового синего).
Краситель плохо сохраняется при делении клеток Клетки делятся слишком быстро, краситель разбавляется Используйте более высокую концентрацию (до 25 мкМ) для быстро делящихся клеток; при необходимости выполните повторное окрашивание.

Хранение

  • Лиофилизированный порошок: хранить при температуре не выше −20°C в сухом месте, защищенном от света. Срок хранения — 1 год.
  • Стоковые растворы в ДМСО: после растворения хранить при −20°C в одноразовых аликвотах. Избегать повторных циклов замораживания и размораживания. При отсутствии влаги стабильны более 6 месяцев.
  • Рабочие растворы: готовить непосредственно в день использования в бессывороточной культуральной среде.

Похожие товары

CytoTracer® Blue CMAC

Cиний флуоресцентный краситель для мечения и долгосрочного трассирования живых клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
4682-10mg 10 mg
$129.90
 в наличии
4682-100mg 100 mg
$620.00 $309.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

CytoTracer® Green CM-BDP®

Нетоксичный, проникающий в клетки зеленый флуоресцентный краситель для мечения и долгосрочного отслеживания живых клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
4699-5mg 5 mg
$164.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

CytoTracer® Orange CMTMR

Проникающий в клетки оранжевый флуоресцентный краситель для мечения и долгосрочного отслеживания живых клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
4276-50ug 50 ug
$22.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.