Быстрое выделение РНК, ДНК и белков реагентом Lumizol

Реагент Lumizol предназначен для быстрого выделения РНК, ДНК и белков из образцов клеток и тканей различного происхождения (растения, животные, бактерии и дрожжи). Lumizol представляет собой раствор, содержащий фенол, изотиоционат гуанидина и другие компоненты, позволяющие получить высококачественные нуклеиновые кислоты и белки. Фенол и изотиоционат гуанидина обеспечивают лизис клеток и эффективно ингибируют рибонуклеазы, тем самым сохраняя РНК интактной. После гомогенизации образцов и добавления хлороформа образец разделится на верхнюю водную фазу, интерфазу и нижнюю органическую фазу. РНК может быть выделена из верхней фазы с помощью изопропанола, белки и ДНК могут быть выделены из интерфазы и органической фазы c помощью спиртов — этанола в случае ДНК и изопропанола в случае белков.

Образцы для выделения:

  • ткани растений и животных — 30–100 мг;
  • адгезионные эукариотические клетки — от 1×105 до 1×10;
  • суспензионные эукариотические клетки, дрожжи — от 5×106 до 10×106;
  • клетки бактерий — 1×107.

Выделение РНК

Наилучшие результаты получаются при выделении РНК из свежих или сразу замороженных в жидком азоте образцов. Не допускается разморозка таких образцов до их гомогенизации в реагенте Lumizol.

  1. Лизируйте образец в реагенте Lumizol в соответствии с его типом:
    • Ткани: Гомогенизируйте образец ткани в 1 мл реагента Lumizol и перенесите гомогенат в новую пробирку объемом 1,5 мл.
    • Клетки: Удалите среду, ресуспендируйте осадок клеток или монослой в 0,5–1 мл реагента Lumizol, перенесите лизат в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  2. (Опционально) Если образец содержит большое количество жира, центрифугируйте лизат 5 мин при 12000 × g и 4°С и перенесите супернатант в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  3. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
  4. Добавьте к лизату 0,2 мл хлороформа (из расчета на 1 мл реагента Lumizol, использованного в лизисе), тщательно перемешайте путем переворачивания пробирки, инкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  5. Центрифугируйте 15 мин при 12000 × g и 4°С. После центрифугирования смесь разделится на две фазы: бесцветную водную и желтую органическую, между которыми будет находиться интерфаза.
  6. Перенесите верхнюю водную вазу в новую пробирку объемом 1,5 мл, не задевая интерфазы. При выделении РНК из небольшого количества образца следует добавить соосадитель к водной фазе. Для выделения белков и ДНК необходимо сохранить пробирки с интерфазой и органической фазой.
  7. Добавьте к водной фазе 0,8 объема изопропанола, тщательно перемешайте, инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
  8. Центрифугируйте 10 мин при 12000 × g и 4°С.
  9. Удалите супернатант, добавьте к осадку РНК 1 мл 70% этанола, тщательно перемешайте и центрифугируйте 5 мин при 7500 g и 4°С.
  10. Удалите супернатант и подсушите осадок РНК 5–10 мин.
  11. Растворите РНК в 50–100 мкл воды, свободной от РНКаз.

Выделение ДНК

  1. Удалите остатки водной фазы с интерфазы, полученной в пункте 5 раздела «Выделение РНК».
  2. Добавьте к интерфазе и органической фазе 0,3 мл 100% этанола (из расчета на 1 мл реагента Lumizol, использованного в пункте 1 раздела «Выделение РНК»), тщательно перемешайте путем переворачивания пробирки и инкубируйте 2–3 мин при комнатной температуре.
  3. Центрифугируйте 5 мин при 2000 × g и 4°С. Супернатант перенесите в новую пробирку объемом 1,5 мл, т. к. его можно использовать для выделения белка.
  4. Ресуспендируйте осадок ДНК в 1 мл раствора (0,1М цитрат натрия в 10% этаноле, pH 8,5).
  5. Инкубируйте 30 мин, периодически перемешивая.
  6. Центрифугируйте 5 мин при 2000 × g и 4°С и удалите супернатант.
  7. Повторите шаги 4–6 еще один раз.
  8. Добавьте 1 мл 70% этанола к осадку ДНК, тщательно перемешайте и центрифугируйте 5 мин при 2000 × g и 4°С.
  9. Тщательно удалите супернатант и подсушите осадок ДНК в течение 5–10 мин.
  10. Ресуспендируйте осадок в 0,3–0,6 мл 8 мМ гидроксида натрия.
  11. Центрифугируйте 10 мин при 12000 × g и 4°С и перенесите супернатант в новую пробирку объемом 1,5 мл, доведите pH до 7–8 путем добавления буфера Tris-HCl [достаточно добавить 5 мкл 1 М раствора Tris-HCl (pH 4,5) на 300 мкл раствора ДНК].

Выделение белков

  1. К супернатанту, полученному в пункте 3 раздела «Выделение ДНК», добавьте 1,5 мл изопропанола (из расчета на 1 мл реагента Lumizol, использованного в пункте 1 раздела «Выделение РНК»), тщательно перемешайте путем переворачивания пробирки, инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
  2. Центрифугируйте 10 мин при 12000 × g и 4°С и удалите супернатант.
  3. Ресуспендируйте осадок в 2 мл раствора (0,3 М гуанидина гидрохлорид в 95% этаноле).
  4. Инкубируйте 20 мин при комнатной температуре.
  5. Центрифугируйте 5 мин при 7500 × g и 4°С и удалите супернатант.
  6. Повторите шаги 4–6 еще два раза.
  7. Добавьте 2 мл 100% этанола, тщательно перемешайте, инкубируйте 20 мин при комнатной температуре.
  8. Центрифугируйте 5 мин при 7500 × g и 4°С и удалите супернатант.
  9. Подсушите осадок белка 5–10 мин.
  10. Растворите белок в буфере, содержащем SDS (например, буфер для нанесения образцов на полиакриламидный гель).

Похожие товары

Lumizol, реагент для экстракции РНК, ДНК и белков

Реагент Lumizol предназначен для быстрого выделения РНК, ДНК и белков из образцов клеток и тканей различного происхождения.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
91415 50 mL $105 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.