Окрашивание клеточных мембран красителями MemBlaze®

MemBlaze® — новое поколение липофильных флуорогенных зондов, разработанных для избирательного окрашивания плазматических мембран живых и фиксированных клеток. В водной среде они формируют самотушащиеся нефлуоресцентные наночастицы. При встраивании в липидный бислой мембраны эти агрегаты разрушаются, позволяя зонду начать ярко светиться (т. н. флуорогенный «turn-on» эффект).

Благодаря низкой проницаемости через мембрану MemBlaze® остаются локализованными в плазматической мембране и не накапливаются в цитоплазме, обеспечивая четкую и стабильную визуализацию клеточной морфологии.

Красители MemBlaze® обеспечивают яркую и контрастную визуализацию границ клеток, отличаются высокой фотостабильностью и интенсивной флуоресценцией. Они нетоксичны для клеток в концентрациях до 1 мкМ. Все это делает их идеальными маркерами для длительной прижизненной визуализации и экспериментов с тайм-лапс съемкой.

Прежде чем начать

  • Все инкубации с MemBlaze® следует проводить в темноте или при минимальном освещении.
  • Красители обладают высокой гидрофобностью, поэтому рабочие растворы лучше готовить в стеклянных пробирках. Ни в коем случае не используйте пробирки с гидрофобным покрытием!
  • Наличие сыворотки в среде снижает эффективность окрашивания. По возможности используйте бессывороточные среды. Если удаление сыворотки невозможно, увеличьте концентрацию зонда.
  • Двухвалентные катионы (Ca²⁺, Mg²⁺) могут способствовать осаждению красителя, поэтому рекомендуется использовать буферы без их содержания.
  • Разбавленный в водной среде рабочий раствор необходимо использовать сразу после приготовления.
  • Красители подходят для окрашивания клеток, фиксированных 4% параформальдегидом (ПФА), однако максимальная интенсивность сигнала достигается при окрашивании живых клеток и их последующей фиксации.
  • Метанол, ацетон и другие органические растворители экстрагируют липиды и поэтому снижают эффективность окрашивания мембран.
  • ПФА частично пермеабилизует мембрану, поэтому при окрашивании фиксированных клеток можно наблюдать некоторую интернализацию зонда.
  • Длительная инкубация живых клеток с зондом, либо выращивание клеток после окрашивания будет сопровождаться интернализацией красителя за счет нормального клеточного метаболизма.
  • Для краткосрочного имиджинга (до 90 минут) предпочтительнее использовать MemBlaze® 488 и MemBlaze® 560. Для более длительного (несколько часов) имиджинга версии с дополнительными бензольными кольцами – использовать MemBlaze® 560 и MemBlaze® 640 предпочтительнее, поскольку дольше сохраняются в мембране.

1. Приготовление стоковых растворов

20 мкМ MemBlaze® (для клеточных культур):

  1. Добавьте 100 мкл DMSO в пробирку с 2 нмоль лиофилизированного красителя.
    Добавьте 500 мкл DMSO в пробирку с 10 нмоль лиофилизированного красителя.
  2. Перемешайте на вортексе в течение 1 минуты.
  3. Неиспользованный раствор можно разделить на аликвоты и хранить при −20°C до 3 месяцев. Перед открытием замороженной пробирки дайте ей согреться до комнатной температуры. Избегайте повторных циклов заморозки/разморозки

200 мкМ MemBlaze® (для тканей или небольших организмов):

  1. Добавьте 10 мкл DMSO в пробирку с 2 нмоль лиофилизированного красителя.
    Добавьте 50 мкл DMSO в пробирку с 10 нмоль лиофилизированного красителя.
  2. Перемешайте на вортексе в течение 1 минуты.
  3. Неиспользованный раствор можно разделить на аликвоты и хранить при −20°C до 3 месяцев. Перед открытием замороженной пробирки дайте ей согреться до комнатной температуры. Избегайте повторных циклов заморозки/разморозки

1% Tween® 20

  1. Добавьте 5 мкл Tween® 20 к 495 мкл деионизированной воды.
  2. Открутите на вортексе в течение 1 минуты.

2. Приготовление рабочих растворов

Важно! Используйте только пробирки без гидрофобного покрытия, либо стеклянные пробирки. Рабочие растворы необходимо использовать сразу после приготовления.

Ниже приведены рекомендуемые концентрации рабочих растворов для разных применений. Точные концентрации зависят от типа клеток/ткани и дизайна эксперимента и должны подбираться опытным путем.

Тип образца Эпифлуоресцентная микроскопия Конфокальная микроскопия
Живые клетки 100 нМ 20 нМ
Фиксированные клетки 100 нМ 20 нМ
Ткань или небольшие организмы 2 мкМ 2 мкМ

Буфер для окрашивания

  1. Рабочий раствор красителя готовится на бессывороточной среде, HBSS или PBS, содержащих 0,005% Tween® 20.
  2. Для приготовления 1 мл буфера для окрашивания добавьте 5 мкл 1% Tween® 20 к 995 мкл среды, HBSS или PBS.
  3. Перемешайте на вортексе.

20 нМ рабочий раствор

  1. Для приготовления 1 мл рабочего раствора к 999 мкл буфера для окрашивания добавьте 1 мкл 20 мкМ MemBlaze®.
  2. Тщательно перемешайте и сразу же используйте.

100 нМ рабочий раствор

  1. Для приготовления 1 мл рабочего раствора к 995 мкл буфера для окрашивания добавьте 5 мкл 20 мкМ MemBlaze®.
  2. Тщательно перемешайте и сразу же используйте.

2 мкМ рабочий раствор

  1. Для приготовления 1 мл рабочего раствора к 980 мкл буфера для окрашивания добавьте 20 мкл 200 мкМ MemBlaze®.
  2. Тщательно перемешайте и сразу же используйте.

3. Окрашивание живых клеток в суспензии

  1. Центрифугируйте клетки при 1000–1500 об/мин в течение 5 минут.
  2. Удалите супернатант и аккуратно ресуспендируйте клетки в предварительно подогретом (37°C) буфере для окрашивания.
  3. Повторите центрифугирование и промывку два раза.
  4. Суспендируйте клетки в плотности 1×10⁶/мл в 20 нМ рабочем растворе красителя.
  5. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре (инкубация при 37°C ускоряет эндоцитоз зонда).
  6. Клетки можно визуализировать без предварительных отмывок.

4. Окрашивание живых адгезированных клеток

  1. Вырастите клетки на покровных стеклах или в камере для визуализации.
  2. Удалите культуральную среду.
  3. Промойте клетки 3 раза предварительно подогретым (37°C) буфером для окрашивания.
  4. Замените буфер 20 нМ рабочим раствором красителя. Используйте объем, достаточный, чтобы полностью покрыть клетки.
  5. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре (инкубация при 37°C ускоряет эндоцитоз зонда).
  6. Клетки можно визуализировать без предварительных отмывок.

5. Фиксация живых клеток после окрашивания

  • Наилучшие результаты достигаются при окрашивании живых клеток ДО фиксации.
  • Клетки, окрашенные красителями MemBlaze®, рекомендуется фиксировать 2–4% ПФА.
  • Фиксация метанолом, ацетоном или другими органическими растворителями экстрагирует липиды, приводя к плохому окрашиванию клеток.
  • Глутаральдегид не рекомендуется для фиксации клеток, поскольку даже низкие его концентрации (0,5%) могут усиливать аутофлуоресценцию и влиять на интерпретацию результатов последующего иммуноцитохимического анализа.

6. Окрашивание фиксированных клеток

  1. Фиксируйте клетки ПФА.
  2. Промойте клетки несколько раз PBS.
  3. Замените буфер 100 нМ рабочим раствором.
  4. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре в темноте.
  5. Промойте клетки 3 раза PBS.
  6. Визуализируйте клетки в PBS. Клетки можно заключать в монтирующие среды с незначительной потерей (около 10%) интенсивности сигнала.

7. Окрашивание свежей ткани

  1. Свежевыделенную ткань промойте в PBS при 4°C.
  2. Нарежьте на срезы толщиной 1 мм.
  3. Поместите срезы в 2–5 мкМ рабочий раствор MemBlaze®. Инкубируйте от 1 до 24 часов при 4°C (или 3 часа при комнатной температуре).
  4. Промойте срезы PBS 3 раза при комнатной температуре.
  5. Визуализируйте срезы в PBS. Клетки можно заключать в монтирующие среды с незначительной потерей (около 10%) интенсивности сигнала.

Важно! При окрашивании ткани мозга красителями MemBlaze® (особенно 560, 640) интенсивность сигнала в нейронах значительно ярче, чем в глиальных клетках. Это необходимо учитывать при планировании экспериментов.

8. Комбинирование с иммуноцитохимическим окрашиванием

  1. Произведите окрашивание клеток красителем MemBlaze®.
  2. Фиксируйте клетки 4% ПФА.
  3. Пермеабилизируйте 0,1% Triton® X-100 в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. Данный метод лучше сохраняет окрашивание плазматической мембраны, чем пермеабилизация дигитонином или сапонином. Использовать более высокие концентрации Triton ® X-100 не рекомендуется.
  4. Выполните стандартный иммуноцитохимический протокол.
  5. При необходимости заключите клетки с помощью монтирующей среды.

9. Детекция

Микроскопия:

Препараты, окрашенные MemBlaze® 488, 560 и 640 могут быть детектированы с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием стандартного набора фильтров (FITC, TRITC, Cy5, соответственно). Для конфокальной и двухфотонной микроскопии подбор фильтров осуществляется опираясь на спектральные свойства красителей:

Краситель Макс.возбуждения, нм Макс.эмиссии, нм Цвет канала
MemBlaze® 488 498 506 Зеленый
MemBlaze® 560 553 567 Оранжево-красный
MemBlaze® 640 648 669 Дальне-красный
MemBlaze® 700 684 710 Ближний инфракрасный

Проточная цитометрия:

Клетки, меченные MemBlaze® 488, 560 и 640, могут быть проанализированы с использованием стандартных каналов детекции проточного цитометра FL1, FL2 и FL3 соответственно.

Источники:

[1] Bioconjugate Chem. 2019, 30, 1, 192–199. [2] Cell Chem. Biol. 2019, 26, 4, 600–614.

Похожие товары

MemBlaze® 488, зеленый флуоресцентный мембранный краситель

Яркий и фотостабильный зеленый флуоресцентный мембранный краситель семейства MEMBRIGHT для быстрого и избирательного окрашивания липидных бислоев в живых или фиксированных клетках.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
12M10
/ 50-300 стекол
2 nmol
$240.00
 в наличии
22M10
/ 250-1500 стекол
10 nmol
$450.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

MemBlaze® 560, оранжевый флуоресцентный мембранный краситель

Оранжевый флуорогенный мембранный краситель семейства MEMBRIGHT для быстрого и высококонтрастного мечения мембран живых и фиксированных клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
13M10
/ 50-300 стекол
2 nmol
$240.00
 в наличии
23M10
/ 250-1500 стекол
10 nmol
$450.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

MemBlaze® 640, дальне-красный флуоресцентный мембранный краситель

Дальне-красный флуоресцентный мембранный краситель семейства MEMBRIGHT, предназначенный для быстрого и высококонтрастного мечения живых и фиксированных клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
15M10
/ 50-300 стекол
2 nmol
$240.00
 в наличии
25M10
/ 250-1500 стекол
10 nmol
$450.00
 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.