Окрашивание живых клеток с помощью митохондриальных красителей LumiTracker® Mito

LumiTracker® Mito представляют собой катионные, проникающие в клетки красители с тиол-реационноспособным хлорметильным фрагментом, активно используемые для мечения митохондрий в живых клетках. Красители LumiTracker® Mito способны пассивно диффундировать через плазматическую мембрану и избирательно накапливаться в активных митохондриях в зависимости от мембранного потенциала в них. Красители LumiTracker® Mito различаются по спектральным характеристикам и их устойчивости к фиксации. Эти свойства обобщены в следующей Таблице.

Краситель Кат. номер MW Возбуждение (нм)* Эмиссия (нм)* Состояние окисления Устойчивость к фиксации
Розаминовые
LumiTracker® Mito Orange CMTMRos 2252-x 427.38 555 578 Окисленная Да
LumiTracker® Mito Orange CM-H2TMRos 4367-x 392.93 Восстановленная Да
LumiTracker® Mito Red CMXRos 2251-x 531.53 581 600 Окисленная Да
Карбоцианиновые
LumiTracker® Mito Green FM 3527-x 671.88 491 513 - Нет
LumiTracker® Mito Red FM 3170-x 724.00 590 643 - Нет

Красители LumiTracker® Mito предназначены для окрашивания живых клеток. Тем не менее, маркеры на основе розамина сохраняются в митохондриях после фиксации и пермеабилизации клеток и совместимы с последующими окрашиваниями методами иммуноцитохимии или гибридизации in situ. Хотя окрашивание митохондрий может быть получено с помощью красителей LumiTracker® Mito на фиксированных клетках, соотношение сигнал/шум обычно при этом не является оптимальным. При необходимости мечения митохондрий в фиксированных клетках, мы рекомендуем использовать антитела против OxPhos.

Прежде чем начать

  • Красители LumiTracker® Mito с восстановленным розамином чувствительны к окислению, особенно в растворе, и должны храниться под аргоном или азотом при температуре ниже −20 °C, в месте защищеннном от света. Мы рекомендуем использовать растворы восстановленного розамина сразу после их приготовления.
  • Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания клеток составляет 25–500 нМ. Рабочее разведение зависит от типа и плотности клеток и должно быть определено экспериментально.
  • Красители LumiTracker® Mito с восстановленным розамином обычно загружаются в клетки в концентрациях, в три-пять раз превышающих концентрации других маркеров LumiTracker® Mito.
  • Оптимальная плотность клеток и продолжительность окрашивания могут различаться в зависимости от типа клеток. Протокол окрашивания должен быть оптимизирован в предварительных экспериментах для достижения наилучших результатов.

Приготовление стокового раствора

  1. Перед открытием каждый флакон должен быть нагрет до комнатной температуры.
  2. Растворите необходимое количество лиофилизированного красителя LumiTracker® Mito в безводном диметилсульфоксиде для получения 1 мМ стокового раствора.
  3. Тщательно перемешайте содержимое пробирки до полного растворения красителя.
  4. Храните стоковый раствор в небольших аликвотах при температуре −20 °C или −80 °C в темноте. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

Приготовление окрашивающего раствора

  • Разбавьте 1 мМ стоковый раствор LumiTracker® Mito до конечной рабочей концентрации в соответствующем буфере или культуральной среде.
    Важно! Восстановленные формы LumiTracker® Mito восприимчивы к потенциальным оксидазам в сыворотке. Мы не рекомендуем использовать полную среду с этими зондами.
  • Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания клеток составляет 25–500 нМ. Рабочее разведение зависит от типа клеток, их плотности и применения. Если клетки после окрашивания необходимо зафиксировать и пермеабилизировать, используйте рабочую концентрацию 100–500 нМ.
  • Для красителя LumiTracker® Mito Green FM используйте концентрацию 20–200 нМ. При высоких концентрациях этот краситель может окрашивать другие клеточные структуры.
    Важно! Старайтесь использовать минимальную концентрацию красителя, чтобы снизить потенциальные артефакты и митохондриальную токсичность от его избыточной загрузки.

Окрашивание клеток

Окрашивание адгезивных клеток

  1. Культивируйте клетки на стерильных покровных стеклах. Адгезионные культуры клеток можно окрашивать непосредственно на покровном стекле.
  2. Удалите культуральную среду и добавьте предварительно нагретый до 37 °C окрашивающий раствор.
  3. Инкубируйте клетки в темноте в течение 15–45 мин в условиях, необходимых для данного типа клеток.
  4. Замените окрашивающий раствор на свежую предварительно нагретую среду или буфер.
  5. Визуализиируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа или флуоресцентного микропланшетного ридера.

Окрашивание суспензии клеток

  1. Получите суспензию отдельных клеток.
  2. Центрифугируйте клетки и аспирируйте супернатант.
  3. Аккуратно ресуспендируйте клетки в предварительно нагретом до 37 °C окрашивающем растворе.
  4. Инкубируйте клетки в темноте в течение 15–45 мин в условиях, необходимых для данного типа клеток.
  5. Центрифугируйте клетки и аспирируйте супернатант.
  6. Ресуспендируйте клетки в свежей предварительно нагретой среде или буфере.
  7. Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра, флуоресцентного микроскопа или флуоресцентного микропланшетного ридера.
  8. Для иммобилизации клеток используйте в процессе монтирования предметные или покровные стрекла, покрытые поли-L-лизином.

Фиксация и пермеабилизация клеток после окрашивания

Эти шаги необязательны, но могут потребоваться для проведения последующей иммуноцитохимии или гибридизации in situ. Используйте протокол, описанный ниже, только для красителей на основе розамина. Сигнал от LumiTracker® Mito Green FM и LumiTracker® Mito Red FM плохо сохраняется после фиксации.

  1. После окрашивания промойте клетки в свежем предварительно нагретом буфере или культуральной среде.
  2. Осторожно аспирируйте буфер или среду.
  3. Фиксируйте клетки в течение 15 мин свежим 2–4% раствором формальдегида, приготовленнго на буфере или среде.
  4. Промойте клетки несколько раз буфером.
  5. Опционально. Если клетки необходимо пермеабилизировать, инкубируйте фиксированные клетки в течение 10 мин в PBS, содержащем 0,2% Triton X-100, после этого промойте клетки PBS. В качестве альтернативы клетки можно пермеабилизировать, инкубируя в ледяном ацетоне в течение 5 мин, а затем промыв в PBS. Пермеабилизацию ацетоном также можно использовать для улучшения соотношения сигнала/фон.

Похожие товары

LumiTracker® Mito Green FM

Проникающий в клетки катионный краситель, флуоресцирующий в зеленой области спектра, для окрашивания активных митохондрий в живых клетках потенциал-зависимым образом.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
3527-50ug 50 ug –   в наличии
3527-500ug 500 ug $199 в наличии
Запросить образец
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

LumiTracker® Mito Orange CM-H2TMRos

Катионный оранжевый флуоресцентный краситель для окрашивания активных митохондрий в живых клетках. CM-H2TMRos является восстановленной нефлуоресцентной версией красителя CMTMRos, который становится флуоресцентным при окислении на митохондриальной мембране.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
4367-50ug 50 ug $24 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

LumiTracker® Mito Orange CMTMRos

Проникающий в клетки катионный краситель, флуоресцирующий в оранжевой области спектра, для окрашивания активных митохондрий в живых клетках потенциал-зависимым образом. Краситель совместим с фиксацией альдегидами.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
2252-50ug 50 ug –   в наличии
2252-500ug 500 ug $125 в наличии
Запросить образец
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

LumiTracker® Mito Red CMXRos

Проникающий в клетки катионный краситель, флуоресцирующий в красной области спектра, для окрашивания активных митохондрий в живых клетках потенциал-зависимым образом. Краситель совместим с фиксацией альдегидами.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
2251-50ug 50 ug –   в наличии
2251-500ug 500 ug $140 в наличии
Запросить образец
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

LumiTracker® Mito Red FM

Проникающий в клетки катионный краситель, флуоресцирующий в красной области спектра, для окрашивания активных митохондрий в живых клетках потенциал-зависимым образом.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
3170-50ug 50 ug $35 в наличии
3170-500ug 500 ug $199 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.