кПЦР с красителем dsGreen®

Флуоресцентный интеркалирующий краситель dsGreen обладает очень высокой чувствительностью к наличию двухцепочечной ДНК и используется для неспецифической детекции амплификации ДНК в ПЦР «в реальном времени» (количественной ПЦР).

1. Если dsGreen хранился при температуре ниже 20 °С необходимо заранее его разморозить и хранить при комнатной температуре в темноте. Для быстрого оттаивания краситель можно инкубировать при температурах до 50 °С.
2. Рассчитайте объемы реагентов, необходимых для постановки реакции согласно протоколу производителя реагентов для ПЦР. Помните, что краситель dsGreen (100х в стоковой концентрации) должен быть разведен в смеси для ПЦР до 1х концентрации.
3. Приготовьте 1х смесь для ПЦР без образцов ДНК согласно протоколу производителя реагентов для ПЦР, добавьте необходимое количество dsGreen. Если Вы используете Taq-полимерзу без горячего старта, держите смесь для ПЦР на льду.
4. Поместите необходимое количество смеси для ПЦР в пробирки для ПЦР, добавьте образцы ДНК.
5. Проведите полимеразную цепную реакцию согласно инструкции к Вашему амплификатору.

Замечания:

При проведении ПЦР-анализа всегда используйте положительный и отрицательный контроли. Программа амплификации для количественной ПЦР не отличается от программы для стандартной ПЦР для конкретных праймеров/матрицы. Для детекции используйте канал FAM (для Rotor-Gene — зеленый канал). Для того, чтобы иметь возможность отличать специфический продукт амплификации от димеров праймеров добавьте в программу амплификации этап со съемкой кривой плавления ампликона.