Years on Market
20

Амплификации ДНК с реакционной смесью для ПЦР ProbeMaster® Lyo GEL, 5×

ProbeMaster® Lyo GEL — готовая лиофилизированная реакционная смесь, содержащая все необходимые компоненты для проведения ПЦР с дальнейшей детекцией результатов методом электрофореза. Ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. Благодаря высокой плотности смеси и наличию в ней красителей (бромфенолового синего и ксиленцианола), образец перед нанесением на гель не нужно смешивать с буфером для нанесения. Наличие двух красителей позволяет четко контролировать время электрофореза.

Реакционная смесь ProbeMaster® Lyo GEL подходит для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза, и может быть использована для рутинных задач по клонированию и других задач, требующих дальнейшего использования продукта ПЦР после амплификации (смесь не содержит UDG/dUTP).

Из-за содержания красителей видимого спектра, ProbeMaster® GEL не подходит для ПЦР в режиме реального времени. При необходимости Вы можете заказать реакционную смесь для ПЦР в реальном времени ProbeMaster® Lyo UNI.

Состав реакционной смеси:

  • HS Taq ДНК-полимераза;
  • смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов;
  • ПЦР-буфер (содержит Mg2+);
  • красители для нанесения на гель;
  • протекторы для лиофилизации.

Ключевые характеристики смеси:

  • Одна пробирка лиофилизованной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
  • Смесь полностью готова к работе. Для постановки реакции в смесь необходимо добавить только образец ДНК, праймеры и воду, что значительно экономит время на постановку реакции. Формат готовой реакционной смеси снижает риск контаминации образцов.
  • Подходит для ПЦР фрагментов длиной до 3 тыс. п.о., не более 70% GC, не требующих высокоточной амплификации.
  • В качестве матрицы может использоваться геномная, вирусная, плазмидная ДНК и др.
  • Cодержит высокопроцессивную Hot-Start Taq-полимеразу с активацией 5 мин при 95°С. Используемая HS Taq ДНК-полимераза представляет собой комплекс моноклональных антител с ферментом. Прогрев образца в первом цикле ПЦР приводит к инактивации антител в составе комплекса и активирует фермент. Технология «горячего старта» позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
  • HS Taq ДНК-полимераза обладает 5′-3′ полимеразной, 5′-3′ экзонуклеазной активностью; также обладает трансферазной активностью: присоединяет дополнительный адениновый остаток к 3′ концам двуцепочечной ДНК, что позволяет использовать продукты ПЦР для ТА-клонирования.
  • Состав и плотность смеси оптимизированы для непосредственного нанесения образца на агарозный гель после завершения амплификации.
  • Благодаря входящим в состав смеси красителям образцы легко наносить на агарозный гель. Наличие двух красителей (бромфенолового синего и ксиленцианола) позволяет четко контролировать время электрофореза.

Возможные приложения:

Cтандартная ПЦР, ОТ-ПЦР, генотипирование, ПЦР для проверки колоний, получение продукта для ТА-клонирования и др.

Совместимость с оборудованием:

Cовместим с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 минуту, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. В дальнейшем восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течении 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 раз замораживать/размораживать смесь после восстановления из лиофилизированной формы.

  1. Разморозьте реакционную смесь, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
  2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
  • Расчет на 1 реакцию объемом 25 мкл*:
    Компонент Объем Примечание
    Реакционная смесь, 5× 5 мкл
    Прямой праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 250–750 нМ)
    Обратный праймер 0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора
    Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 25 мкл* С учетом объема образца ДНК, который будет добавлен в п.4
    ДНК 2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК) Добавляется отдельно в каждую пробирку в п.4
    Общий объём реакции 25 мкл* При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
    * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако работать с объемом реакции менее 10 мкл не рекомендуется.
  1. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
  2. Внесите в каждую пробирку отдельным наконечником пипетки 2–9 мкл образца ДНК. После добавления ДНК суммарный объём реакции должен составить 25 мкл. Закройте крышки пробирок, сбросьте капли центрифугированием.
  3. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).
  • Если температура отжига праймеров ≥60°С
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40
    Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)     		60–72°С 30–60 с
  • Если температура отжига праймеров <60°C
    Стадия Температура Время Число циклов
    Активация HS Taq-полимеразы 95°С 5 мин 1
    Денатурация 95°С 10 с 40
    Отжиг праймеров
    (на этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)    		 55–59°С 10–15 с
    Элонгация 72°С 15–30 с
  1. Проанализируйте результаты ПЦР методом гель-электрофореза. Для нанесения образцов влунки геля добавление в пробу буфера для нанесения не требуется.
    Для детекции продуктов амплификации на агарозном геле используйте бромистый этидий или более чувствительные и менее токсичные красители dsGreen и dsSafe.
  2. При необходимости хранить продукты амплификации при −20°С.

Условия хранения

  • 12 месяцев (с момента доставки) при температуре до +4°C. Транспортировка: до 21 суток при температуре до +25°С.
  • После восстановления в жидкую форму – хранить при +4°С до 30 суток или при −20°С в пределах срока годности. Продукт в жидкой форме не теряет функциональных свойств после 5 циклов заморозки-разморозки.
  • Срок годности: 12 месяцев с даты поставки, если иное не указано в паспорте товара.

Похожие товары