Амплификация ДНК с реакционной смесью для кПЦР ProbeMaster® Lyo GEL UDG

ProbeMaster^® Lyo GEL UDG — готовая 5-кратная реакционная смесь, содержащая все необходимые компоненты для проведения ПЦР с дальнейшей детекцией результатов методом электрофореза. Ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации. Благодаря высокой плотности смеси и налиличие в ней красителей (Бромфенолового Синего и Ксиленцианола), образец перед нанесением на гель не нужно смешивать с буфером для нанесения. Наличие двух красителей позволяет четко контролировать время электрофореза.

Реакционная смесь ProbeMaster^® Lyo GEL UDG подходит для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. Урацил-ДНК-гликозилаза при этом исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов, что особенно актуально при проведении электрофореза ампликонов. Из-за содержания dUTP cмесь не подходит для задач, в которых необходимо использовать в дальнейшем продукты амплификации. Для таких задач мы рекомендуем использовать наш продукт ProbeMaster^® Lyo GEL.

Состав реакционной смеси:

• HS Taq ДНК-полимераза;
• урацил-ДНК-гликозилаза (UDG);
• смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP);
• ПЦР-буфер (содержит Mg²⁺ с концентрацией 3 мМ в 1× реакционной смеси)
• красители для нанесения на гель
• Протекторы для лиофилизации.

Ключевые характеристики смеси:

• Одна пробирка лиофилизованной смеси после разведения в 450 мкл воды рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл.
• Смесь полностью готова к работе. Для постановки реакции в смесь необходимо добавить только образец ДНК, праймеры и воду, что значительно экономит время на постановку реакции.
• Урацил-ДНК-гликозилаза исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов, что особенно актуально при проведении электрофореза ампликонов.
• Подходит для ПЦР фрагментов длиной до 3 тыс. п.о., не более 70% GC, не требующих высокоточной амплификации.
• В качестве матрицы может использоваться геномная, вирусная, плазмидная ДНК и др., а также кДНК, полученная при обратной транскрипции.
• Cодержит высокопроцессивную Hot-Start Taq-полимеразу с активацией 5 мин при 95°С. Используемая HS Taq ДНК-полимераза представляет собой комплекс моноклональных антител с ферментом. Прогрев образца в первом цикле ПЦР приводит к инактивации антител в составе комплекса и активирует фермент. Технология «горячего старта» позволяет предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
• Состав и плотность смеси оптимизированы для непосредственного нанесения образца на агарозный гель после завершения амплификации.
• Благодаря входящим в состав смеси красителям образцы легко наносить на агарозный гель. Наличие двух красителей (Бромфенолового Синего и Ксиленцианола) позволяет четко контролировать время электрофореза.

Возможные приложения:

ПЦР с детекцией продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза, ПЦР после обратной транскрипции.

Совместимость с оборудованием:

Совместим с амплификаторами любого типа.

Протокол

Перед началом работы добавьте в лиофилизированную смесь 450 мкл деионизированной воды, подождите 1 минуту, перемешайте содержимое пробирки на вортексе и сбросьте капли центрифугированием. В дальнейшем восстановленную смесь можно хранить при +4°С в течение 30 суток или заморозить и хранить в пределах срока годности при −20°С. Допускается до 5 раз замораживать/размораживать смесь после восстановления из лиофилизированной формы.

1. Разморозьте реакционную смесь, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
2. Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием.
   Расчет на 1 реакцию объемом 25 мкл*:

   Компонент	Объем	Примечание
   Реакционная смесь, 5×	5 мкл
   Прямой праймер	0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора	5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 250–750 нМ)
   Обратный праймер	0,5–1,5 мкл 10 мкМ раствора
   Деионизованная вода	Добавляется до общего объема реакции 25 мкл*
   ДНК	2–9 мкл (кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)	Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.4)
   Общий объём реакции	25 мкл*	При использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций

   * Объем реакции можно менять в зависимости от конкретной задачи, однако работать с объемом реакции менее 10 мкл не рекомендуется.
3. В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК.
4. Внесите образцы ДНК отдельно в каждую пробирку, сбросьте капли центрифугированием.
5. Проведите амплификацию ДНК с использованием приведенных программ (температура отжига праймеров рассчитывается индивидуально для каждой пары праймеров).

• Если температура отжига праймеров ≥60°С

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
  Денатурация	95°С	10 с	40
  Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией**	60–72°С	30–60 с

• Если температура отжига праймеров <60°C

  Стадия	Температура	Время	Число циклов
  Активация HS Taq-полимеразы	95°С	5 мин	1
  Денатурация	95°С	10 с	40
  Отжиг праймеров**	55–59°С	10–15 с
  Элонгация	72°С	15–30 с

** При необходимости детекция флуоресценции должна производиться на этом этапе.

6. Проанализируйте результаты ПЦР методом гель-электрофореза. Для нанесения образцов в лунки геля добавление в пробу буфера для нанесения не требуется.
   Для детекции продуктов амплификации на агарозном геле используйте бромистый этидий или более чувствительные и менее токсичные красители dsGreen и dsSafe.
7. При необходимости хранить продукты амплификации при −20°С.

Условия хранения

• Хранение: 12 месяцев (с момента доставки) при температуре до +4°C.
• Транспортировка: до 21 суток при температуре до +25°С.
• После восстановления в жидкую форму – хранить при +4°С до 30 суток или при −20°С в пределах срока годности. Продукт в жидкой форме не теряет функциональных свойств после 5 циклов заморозки-разморозки.