Инструкция к набору для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1].

Одним из ранних проявлений программируемой клеточной гибели (апоптоза) является нарушение асимметрии фосфолипидного бислоя. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным аннексином V. Данная транслокация опосредована активацией скремблазы Xkr8, после ее расщепления эффекторной каспазой-3. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), связывание аннексина V с ФС позволяет различать популяции здоровых (АннексинPI), апоптотических (Аннексин+PI) и некротических (Аннексин+PI+) клеток [2] и проводить количественный анализ клеточной гибели в результате апоптоза и/или некроза.

Изображение

AF488 — сульфированный родамин, яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор. Краситель излучает в зеленом (FITC) канале. Максимум поглощения — 495 нм. Максимум эмиссии — 519 нм.

Йодистый пропидий (PI) — непроницаемый через плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

Данный набор для определения апоптотических клеток рассчитан на 50 тестов и содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с AF488, и йодистого пропидия.

Состав набора

Компонент набора Количество
11172
10 assays
21172
50 assays
11515, Аннексин V-AF 488 конъюгат, 1 ug 1
21515, Аннексин V-AF 488 конъюгат, 5 ug 1
19010, Пропидий Йодистый, 100 uL, 0.1 mg/mL in water 1 1
83215, Буфер для связывания аннексина V, 5х, 15 mL 1 1

Транспортировка: до одной недели при комнатной температуре. Хранение: при -20°С.

Срок хранения 9 месяцев.

Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF488 — от 2 до 5 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF488 для определения оптимальной концентрации.

Окрашивание с помощью йодистого пропидия — опционально. Этот этап можно пропустить, если в задачах нет необходимости исследовать некроз.

Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Приготовление растворов

  1. Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF488 (11172) в 50 мкл деионизованной воды. / Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF488 (21172) в 250 мкл деионизованной воды.
    Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!
  2. Приготовьте необходимый объём 1х буфера для связывания, смешав 1 часть 5х буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.

Окрашивание клеток

  1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
  2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.
  3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.
  4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×105 до 1×106 клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).
  5. Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF488 в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
  6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
  7. (Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.
  8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.
    Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.

Проточная цитометрия

  1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF488 и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF488, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).
  2. Анализ связывания аннексина V-AF488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.
  3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.

Флуоресцентная микроскопия

  1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
  2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
  3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF488, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
  4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя двойной набор фильтров для FITC и родамина.

Результат окрашивания

  • Ранние апоптотические клетки, связавшие аннексин V-AF488, окрашиваются в зеленый цвет в плазматической мембране.
  • Некротические клетки в результате проникновения йодистого пропидия внутрь клетки будут окрашены красным.
  • Апоптотические клетки с нарушенной в результате вторичного некроза целостностью мембраны будут иметь красное окрашивание (йодистый пропидий) и ореол зеленого окрашивания (AF488) на клеточной поверхности (плазматическая мембрана).
  • Здоровые клетки будут лишены окрашивания.

Ссылки

[1] Koopman G., Reutelingsperger C.P., Kuijten G.A., Keehnen R.M., Pals S.T., van Oers M.H. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 1994. 84(5). P.1415-20.

[2] Martin S.J., Reutelingsperger C.P., McGahon A.J., Rader J.A., van Schie R.C., LaFace D.M., Green D.R. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J Exp Med. 1995. 182(5). P.1545-56.

Наборы

Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF 488

Набор для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с AF 488, и йодистого пропидия.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
11172
10 assays
–   1 д
21172
50 assays
$215 $169 1 д
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.