Реакционная смесь для ПЦР/кПЦР ProbeMaster®️ UDG, 5x
Смесь PCR/qPCR c UDG подходит как для проведения количественной ПЦР, так и для амплификации ДНК с последующей детекцией результатов методом электрофореза. Готовая 5-кратная реакционная смесь содержит необходимые компоненты для проведения ПЦР, ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов по процессивности и специфичности амплификации (содержит Hot-start полимеразу), а урацил-ДНК-гликозилаза исключает контаминацию ампликонами от предыдущих реакций и получение ложноположительных результатов. В случае постановки реакции кПЦР, для детекции флуоресценции следует использовать ДНК-зонд, меченный флуорофором и тушителем (гидролизуемые зонды, «молекулярные маяки», праймеры типа «скорпион») или два зонда, меченных флуорофорами, образующими FRET-пару (вы можете заказать синтез зондов в Lumiprobe). Помимо ДНК-зондов, для детекции флуоресценции может использоваться интеркалирующий краситель dsGreen (dsGreen). Объем смеси 1 мл рассчитан на проведение 200 реакций объемом 25 мкл.
Состав реакционной смеси: HS Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP), урацил-ДНК-гликозилаза (UDG), ПЦР-буфер (содержит Mg2+ с концентрацией 3 мМ в 1х реакционной смеси).
Совместимость с оборудованием: совместим с амплификаторами любого типа.
Возможные приложения: качественная и количественная ПЦР с детекцией продуктов амплификации как в режиме реального времени, так и с помощью гель-электрофореза, ПЦР после обратной транскрипции.
Протокол
- Разморозьте реакционную смесь при комнатной температуре, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
- Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли центрифугированием. ! Для получения воспроизводимых результатов ПЦР рекомендуется ставить реакции в 2 и более повторах для каждого образца ДНК. ! Объем реакции может варьироваться в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции менее 10 мкл не рекомендуется.
- В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК. Образцы ДНК внесите отдельно в каждую пробирку, закройте крышки пробирок, стрипов или заклейте планшет плёнкой, сбросьте капли центрифугированием.
- Если температура отжига праймеров ≥60 °C
Стадия Температура Время Число циклов Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1 Денатурация 95 °C 10 сек 40 Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)60–72 °C 30–60 сек - Если температура отжига праймеров <60 °C
Стадия Температура Время Число циклов Активация HS Taq-полимеразы 95 °C 5 мин 1 Денатурация 95 °C 10 сек 40 Отжиг праймеров
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)55–59 °C 10–15 сек Элонгация 72 °C 15–30 сек ! В случае использования интеркалирующего красителя, после проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95 °C.
-
Для анализа результатов ПЦР методом гель-электрофореза: смешайте образцы с буфером для нанесения на гель и внесите их в лунки геля, проведите электрофорез.
! При необходимости хранить продукты амплификации при −20 °С.
Компонент | Объем | Примечание |
---|---|---|
5х Реакционная смесь PCR/qPCR с UDG | 5 мкл | |
Прямой праймер | 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора |
5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ) |
Обратный праймер | 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора | |
Зонд — или — Интеркалирующий краситель |
0.25–0.75 мкл 10 мкМ раствора |
2.5–7.5 пмоль/реакцию (конечная концентрация 100–300 нМ) |
Согласно рекомендации производителя | ||
Деионизованная вода | Добавляется до общего объема реакции 25 мкл | |
ДНК |
2–9 мкл (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК) |
Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3) |
Общий объём реакции | 25 мкл* |
Компонент | Объем | Примечание |
---|---|---|
5х Реакционная смесь PCR/qPCR c UDG | 5 мкл | |
Прямой праймер | 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора | 5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 200–600 нМ) |
Обратный праймер | 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора | |
Деионизованная вода | Добавляется до общего объема реакции 25 мкл | |
ДНК |
2–9 мкл (кДНК, 30–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК) |
Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3) |
Общий объём реакции | 25 мкл* |
Программа амплификации
Для расчёта температуры плавления (Tm) праймеров рекомендуется использовать стандартные инструменты, работающие по алгоритму Nearest-Neighbor (SantaLucia J Jr., 1998). Температура отжига праймеров рассчитывается по формуле Ta=Tm-5 °C.
Хранение: −20 °С.
Число циклов замораживания/размораживания: не более 20.
Срок годности: 12 месяцев с даты поставки при соблюдении условий хранения и транспортировки.