Инструкция к набору LumiSpin BB для выделения ДНК на спин-колонках из цельной крови и буккального эпителия

Набор предназначен для быстрого (~ 30 минут) и высокоэффективного выделения тотальной ДНК (геномной, митохондриальной и вирусной) из цельной крови, буккального эпителия, лейкоцитов, культур клеток млекопитающих на спин‑колонках. Полученная ДНК стабильна и подходит для проведения ПЦР, обработки эндонуклеазами рестрикции, Саузерн-блоттинга, подготовки образцов для секвенирования по методу Сэнгера и NGS-секвенирования.

Ориентировочные выходы геномной ДНК (длина 30–50 тыс. пар нуклеотидов, OD₂₆₀/OD₂₈₀ 1.7–1.8):

Цельная кровь (100 мкл): 1–3 мкг
Соскоб буккального эпителия: 0.5–2 мкг
Клетки млекопитающих (1×10⁶): 3–6 мкг

Состав набора

Компонент набора	Количество
Компонент набора	11553 10 minipreps	21553 50 minipreps
12164, Spin column (up to 20 µg), 10 pcs	1	—
F4150, Лизирующий раствор BB / Lysis Solution BB, 4 mL	1	—
H2450, Промывочный раствор A / Wash Solution A (с GuHCl), 6 mL	1	—
22164, Spin column (up to 20 µg), 50 pcs	—	1
M4150, Лизирующий раствор BB / Lysis Solution BB, 20 mL	—	1
P2450, Промывочный раствор A / Wash Solution A (с GuHCl), 30 mL	—	1
Пробирка для сбора проскока, 2 мл	30	150
K2250, Промывочный раствор B / Wash Solution B (концентрат 5x для разбавления 96% этанолом), 10.0 mL	1	1
D1350, Элюирующий буфер / Elution Buffer (10 мМ Tris-HCl, pH 8.5), 1.5 mL	1	4
12850, Протеиназа К / Proteinase К (лиофилизованная), 6.0 mg	1	1
B3850, Буфер для растворения протеиназы К / Proteinase K Dilution Buffer, 600 uL	1	1

Хранить при комнатной температуре.

Срок хранения 12 месяцев.

Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора:

Твердотельный термостат (возможно использование водяной бани);
Настольная центрифуга с ротором для 1.5 мл пробирок со скоростью вращения не менее 10000 об/мин (6700 × g);
Микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл (2 пробирки для выделения ДНК из 1 образца);
96 % этанол;
Натрий-фосфатный буфер (PBS) для выделения ДНК из клеток млекопитающих.

Перед началом работы

Разбавьте концентрат промывочного раствора B в 5 раз 96 % этанолом (к указанному на банке объему концентрата добавьте 4 объема 96 % этанола), поставьте отметку о добавлении этанола на крышке.
Добавьте 600 мкл буфера для растворения протеиназы К в пробирку с лиофилизованной протеиназой К, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
! Раствор протеиназы К после приготовления хранить в морозилке при −20 °С.
При наличии осадка в лизирующем растворе BB и промывочном растворе А прогрейте их в термостате до температуры не выше 50 °С и дождитесь полного растворения осадка.

Работы следует выполнять при комнатной температуре, все центрифугирования (если иное прямо не оговорено) при 10000–13000 об/мин (6700–11000 × g).

Выделение ДНК из цельной крови

Данный набор предназначен для выделения ДНК из образцов цельной крови объемом 100 мкл (свежая или замороженная кровь, содержащая в качестве антикоагулянта ЭДТА, цитрат натрия, гепарин). Для более высокого выхода ДНК можно использовать предварительно выделенные лейкоциты (рекомендуемый объём цельной крови для выделения лейкоцитов 1–2 мл).

Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
Перемешайте переворачиванием пробирку с кровью, чтобы содержимое пробирки стало гомогенным, после чего отберите 100 мкл образца в отдельную 1.5 мл пробирку.
В пробирку с образцом внесите 300 мкл лизирующего раствора BB и 10 мкл раствора протеиназы К, тщательно перемешайте содержимое пробирки на вортексе.
Инкубируйте полученную смесь 15 мин при 55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–200 мкл предварительно прогретого до 55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 2 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из соскоба буккального эпителия

Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
Внесите в чистую 1.5 мл пробирку 300 мкл лизирующего раствора BB.
Тщательно промойте в лизирующем растворе BB палочку с соскобом буккального эпителия. Прижмите к стенке ватный тампон и вращательным движением отожмите из него остатки лизирующего раствора.
Добавьте в пробирку с образцом 10 мкл раствора протеиназы К, тщательно перемешайте содержимое пробирки на вортексе.
Инкубируйте полученную смесь 15 мин при 55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–200 мкл предварительно прогретого до 55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 2 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из культур клеток млекопитающих

Для выделения ДНК рекомендуется брать не более 5×10⁶ клеток.

Адгезионная культура клеток: удалите культуральную жидкость, снимите клетки с поверхности пластика трипсином или другим рекомендованным для данной культуры методом. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 × g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую 1.5 мл пробирку.

Суспензионная культура клеток: отберите объём культуральной жидкости, содержащий необходимое число клеток. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 × g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую 1.5 мл пробирку.

Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
В пробирку с образцом внесите 300 мкл лизирующего раствора BB и 10 мкл раствора протеиназы К, тщательно перемешайте содержимое пробирки на вортексе.
Инкубируйте полученную смесь 15 мин при 55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–200 мкл предварительно прогретого до 55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 2 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Примечание

Для получения наибольшей концентрации ДНК используйте меньшие объёмы элюирующего буфера. Не рекомендуется использовать менее 50 мкл, так как мембрана колонки может не полностью смочиться, что приведет к снижению выхода ДНК. Для наибольшего выхода ДНК с колонки используйте больший объём элюирующего буфера (100–200 мкл).

Элюция ДНК прогретым до 55 °С элюирующим буфером обеспечивает оптимальный выход ДНК с колонки. Элюция непрогретым элюирующим буфером (при комнатной температуре) также допустима, однако это заметно снижает выход ДНК (на 30–50 %).

Для максимального выхода ДНК рекомендуется проводить элюцию в два этапа.

При необходимости элюция может проводиться деионизованной водой.

Если необходимо разбавить раствор при измерении концентрации ДНК, то для разбавления следует использовать только буфер ТЕ pH 8.5 или элюирующий буфер из набора. В противном случае можно получить некорректные значения OD₂₆₀/OD₂₈₀ и неверно определить содержание ДНК в растворе.

Хранение выделенной ДНК: в морозильной камере (−20 °С), кратковременно при +4 °С.

Наборы

LumiSpin BB, набор для выделения ДНК на спин-колонках из цельной крови и буккального эпителия

Набор для быстрого выделения геномной ДНК с высокой степенью очистки из цельной крови, буккального эпителия, лейкоцитов, культур клеток млекопитающих.

Показать цены