Инструкция к набору QuDye ssDNA для определения количества одноцепочечной ДНК

Набор предназначен для определения концентрации одноцепочечной ДНК на флуориметре. С помощью данного набора может быть измерена концентрация как длинной одноцепочечной ДНК, так и коротких олигонуклеотидов; свободные нуклеотиды не связываются с красителем и не влияют на результаты измерений. Краситель QuDye ssDNA не обладает селективностью по отношению к одноцепочечной ДНК и также связывает двухцепочечную ДНК и РНК, поэтому следует исключить их присутствие в образце. Другие примеси в незначительном количестве, такие как соли, детергенты, растворители, белки оказывают несущественное влияние на результаты измерений (Табл. 1), однако рекомендуется минимизировать или полностью исключить их присутствие в образце.

Все поставляемые реагенты оптимизированы для работы на флуориметре, диапазон измеряемых концентраций ДНК составляет 50 пг/мкл–200 нг/мкл для исходного образца (конечное содержание ДНК в пробирке после разбавления образца в рабочем растворе красителя 1–200 нг).

Состав набора

Компонент набора	Количество
Компонент набора	17102 100 assays	18102 100 assays (incl. tubes)
Пробирка тонкостенная (0.5 mL прозрачный полипропилен)	—	100
35010, Краситель QuDye ssDNA / QuDye ssDNA Reagent, 200x, 250 uL	1	1
S3250, Буфер TE, 1x, 50 mL	1	1
B9650, Стандарт / Quantitative standard, 0 нг/мкл в TE буфере, 1 mL	1	1
B2650, Стандарт оцДНК / ssDNA quantitative standard, 20 ng/uL в TE буфере, 1 mL	1	1

Хранить при температуре +4°С. Прогреть до +20°С перед использованием.

Срок хранения 12 месяцев.

! Все измерения с использованием набора QuDye ssDNA должны проводиться при комнатной температуре (22–28°С). Перед началом работы тщательно прогрейте все используемые растворы до комнатной температуры. При постоянном использовании набора рекомендуется хранить краситель QuDye ssDNA и 1х буфер TE при комнатной температуре, стандарты при температуре +4°С.

! Обращаем Ваше особое внимание на то, что колебания температуры образца оказывают значительное влияние на результаты измерений. Избегайте нагрева образцов, в частности, не держите в руках пробирки с образцами непосредственно перед измерениями на флуориметре. Поскольку даже кратковременное нахождение пробирки с образцом в гнезде флуориметра; способствует нагреву образца, проводите измерения флуоресценции сразу после того, как поместите пробирку с образцом в гнездо флуориметра. При необходимости повторного измерения одного и того же образца, следует извлекать пробирку с образцом из флуориметра сразу после измерения и помещать образец в гнездо флуориметра только на период измерения интенсивности флуоресценции.

Протокол

Приготовьте рабочий раствор красителя QuDye ssDNA из расчета, что на каждый образец и на каждый из двух стандартов потребуется около 200 мкл. Для этого разведите 200х концентрат красителя QuDye ssDNA в 200 раз 1х TE буфером.
Например, для измерения 3 образцов и 2 стандартов необходимо приготовить 200 мкл x 5 = 1000 мкл рабочего раствора красителя (смешайте 5 мкл концентрата красителя QuDye ssDNA и 995 мкл 1х TE буфера).
! Рабочий раствор красителя рекомендуется использовать в течение нескольких часов после приготовления. При проведении отсроченных измерений рекомендуется беречь от света готовый рабочий раствор красителя.
! Для приготовления рабочего раствора красителя используйте только пластиковую посуду. Стеклянная посуда может сорбировать на своих стенках краситель, что приведёт к снижению концентрации красителя в образцах и искажению результатов измерений.
Подготовьте две тонкостенные, оптически прозрачные пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл для стандартов и по одной пробирке для каждого измеряемого образца. Подпишите крышки пробирок (не делайте пометок на стенках пробирок, так как это может привести к некорректному определению интенсивности флуоресценции).
В каждую пробирку для стандартов внесите 190 мкл рабочего раствора красителя QuDye ssDNA и 10 мкл Quantitative standard, 0 ng/µL (Стандарт #1) и ssDNA quantitative standard, 20 ng/µL (Стандарт #2) соответственно. Перемешайте на вортексе 2–3 секунды, сбросьте капли.
В каждую пробирку для образцов внесите 180–199 мкл рабочего раствора красителя QuDye ssDNA и 20–1 мкл образца соответственно (конечный объём в каждой пробирке должен составить 200 мкл). Перемешайте на вортексе 2–3 секунды, сбросьте капли.
Разведение исследуемого образца опционально и зависит от его исходной концентрации. Исходная концентрация образца должна соответствовать диапазону 50 пг/мкл–200 нг/мкл. Для измерений на флуориметре конечное содержание ДНК в пробирке после разбавления образца в рабочем растворе красителя должно находиться в диапазоне 1–200 нг. В то же время следует избегать использования маленьких объёмов при разбавлении исходного образца, поскольку неточность пипетирования маленьких объёмов может сказаться на результатах измерений.
Инкубируйте все пробирки (содержащие стандарты и исследуемые образцы) 2 минуты при комнатной температуре.
Проведите измерение интенсивности флуоресценции.

Измерение интенсивности флуоресценции на флуориметре

Следующие пункты следует выполнять согласно инструкции к флуориметру. В зависимости от версии флуориметра пункты меню могут отличаться от приведенных ниже.

После включения прибора выберите пункт ssDNA. Нажмите Go.
При каждом новом приготовлении рабочего раствора красителя следует проводить калибровку флуориметра. Выберете пункт Run new calibration и нажмите Go.
Поместите в гнездо пробирку, содержащую стандарт #1, закройте крышку, нажмите Go. Когда прибор проведет измерение (около 3 сек), удалите пробирку со стандартом #1. Поместите в гнездо пробирку, содержащую стандарт #2, закройте крышку, нажмите Go. Когда прибор проведет измерение, удалите пробирку со стандартом #2.
После успешного завершения калибровки поместите в гнездо пробирку с экспериментальным образцом, закройте крышку, нажмите Go. На экране прибор покажет значение QF Value.
Рассчитайте концентрацию ДНК по формуле: Концентрация ДНК в образце = значение QF x 200/объём образца; или введите объём образца в прибор.

Таблица 1. Влияние примесей на интенсивность флуоресценции при измерении концентрации одноцепочечной ДНК набором QuDye ssDNA

Примеси	Конечная концентрация в измеряемом образце	Изменение интенсивности флуоресценции (увеличение↑ или уменьшение↓)
Ацетат натрия	30 мМ	↓	Незначительное (менее 10%)
Агароза	0.1%	↑
Хлороформ	2%	↑
Ацетат аммония	50 мМ	↓	Умеренное (10-20%)
Фенол	0.2%	↓
Этанол	10%	↑
Тритон Х-100	0.1%	↑
Бычий сывороточный альбумин	2%	↑	Существенное (более 20%)
IgG	0.1%	↓
Хлорид натрия	100 mM	↓
Хлорид цинка	1 мМ	↓
Хлорид магния	5 мМ	↓
Мочевина	2 М	↑
SDS	0.01%	↑
Полиэтиленгликоль	1%	↑
АТФ	0.1%	↑

Наборы

Набор QuDye для определения количества одноцепочечной ДНК

Набор для точного и высокочувствительного определения концентрации одноцепочечной ДНК на флуориметре в диапазоне 50 пг/мкл–200 нг/мкл для исходного образца.

Показать цены