Набор для определения концентрации двухцепочечной ДНК с реагентом Pico488

Набор Pico488 для определения количества ДНК предназначен для определения низких концентраций двухцепочечной ДНК (не определяемых спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм). Благодаря селективному связыванию красителя Pico488 c двухцепочечной ДНК на результаты измерения не влияет присутствие в пробе нуклеотидов, одноцепочечной ДНК, РНК, белков и других примесей.

Линейный диапазон измерения концентрации ДНК с использованием набора составляет от 1 пг/мкл до 5 нг/мкл. Краситель, связанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм. Для проведения измерений подойдет любой тип флуориметра.

Состав набора

Компонент набора Количество
1102-200
200 assays
B1102
200 assays
42010, Краситель Pico488 для определения концентрации дцДНК, 200x раствор в ДМСО, 1 mL 1
12010, Краситель Pico488 для определения концентрации дцДНК, 200x раствор в ДМСО, 100 uL 10
N2150, TE buffer, 20x, 25 mL 1 1
B8650, dsDNA quantitative standard, 100 ng/uL in TE buffer, 1 mL 1 1

Хранить при температуре до 4°С. Не замораживать!

Срок хранения 12 месяцев.

Указанное выше количество реагентов рассчитано для проведения 200 измерений при работе с объемом измеряемого образца 2 мл (минимально необходимый объём образца для измерений в стандартной флуориметрической кювете объёмом 3.5 мл). Количество измерений может варьироваться в зависимости от объема образца. Рекомендуемые объёмы образца для наиболее популярного флуориметрического оборудования представлены ниже в таблице.

Рекомендуемые объёмы для измерения концентрации ДНК с помощью красителя Pico488

Тип оборудования Общий объём образца (Vобразца) Объём рабочего раствора красителя Pico488 Объём экспериментального раствора ДНК
Кюветный флуориметр Стандартная флуориметрическая кювета (3.5 мл) 2 мл 1 мл 1 мл
Другие флуориметрические кюветы около 75% объёма кюветы 37.5% объёма кюветы 37.5% объёма кюветы
Планшетный флуориметр 96-луночный планшет*, на лунку 0.2 мл 0.1 мл 0.1 мл
24-луночный планшет, на лунку 1 мл 0.5 мл 0.5 мл
Другие планшеты около 75% объёма лунки 37.5% объёма лунки 37.5% объёма лунки
NanoDrop™ 3300* 0.1 мл 0.05 мл 0.05 мл

* Для обеспечения точности измерений рекомендуется избегать дозирования объёмов менее 2 мкл.

Протокол

! Чтобы нивелировать возможные ошибки дозирования, мы рекомендуем приготовить 1х TE буфер и рабочий раствор красителя Pico488 с запасом 10-25%.

1. Приготовление 1х TE буфера.

Приготовьте необходимое количество 1х буфера исходя из объёма образца и количества измеряемых образцов (включая 5 разведений стандартного раствора ДНК, см. п.3). Для получения 1х буфера разведите 20х концентрат TE буфера в 20 раз деионизированной водой (уточните в таблице выше рекомендуемый объём образца для используемого оборудования).

Для расчета необходимого объёма буфера (V1х буфера) воспользуйтесь следующей формулой:

V буфера = Vобразца × (Nобразцов+ 5),

где Vобразца – измеряемый объем исследуемого образца или стандарта, Nобразцов – количество измеряемых образцов, и 5 – количество измеряемых стандартов (включая образец с нулевой концентрацией ДНК).

2. Приготовление рабочего раствора красителя Pico488.

Разморозьте и тщательно перемешайте содержимое пробирки с красителем. Приготовьте достаточное количество рабочего раствора красителя для всех образцов: объём рабочего раствора красителя должен составить 50% от общего объёма измеряемого образца. Для получения рабочего раствора красителя разведите 200х концентрат красителя Pico488 в 200 раз приготовленным 1х TE буфером.

! Готовый рабочий раствор красителя пригоден для использования в течение 3 часов.

Для расчета необходимого объёма рабочего раствора красителя (VPico488) воспользуйтесь следующей формулой:

VPico488 = 1/2 × Vобразца × (Nобразцов+ 5),

где Vобразца – измеряемый объем исследуемого образца или стандарта, Nобразцов – количество измеряемых образцов, и 5 – количество измеряемых стандартов (включая образец с нулевой концентрацией ДНК).

! Для приготовления рабочего раствора красителя используйте только пластиковую посуду. Стеклянная посуда может сорбировать на своих стенках краситель, что приведет к снижению концентрации красителя в образцах и, как следствие, скажется на результатах измерений.

3. Приготовление стандартных растворов ДНК.

Приготовьте стоковый раствор ДНК с концентрацией 2 нг/мкл в 1х ТЕ буфере: внесите в пробирку 30 мкл стандарта из набора и 1,47 мл 1х ТЕ буфера. Используя этот стоковый раствор, приготовьте стандартные растворы ДНК следующих концентраций: 2 нг/мкл, 200 пг/мкл, 20 пг/мкл, 2 пг/мкл (см. таблицу ниже).

! Предлагаемая схема разведений стандартного раствора ДНК дана с запасом на погрешности дозирования при приготовлении разведений с концентрацией ДНК 0-2 нг/мкл. Приготовленного по данной схеме стокового раствора ДНК объёмом 1,5 мл достаточно для приготовления стандартных растворов ДНК при проведении измерений в кювете 3,5 мл (объем образца 2 мл). При использовании меньшего объёма образца стоковый раствор ДНК может быть приготовлен в меньшем объёме.

Объем 1х ТЕ буфера, мкл Объем стокового раствора ДНК 2 нг/мкл, мкл Концентрация стандартного раствора ДНК Конечная концентрация стандарта в измеряемом объеме
0 1000 2 нг/мкл 1 нг/мкл
900 100 200 пг/мкл 100 пг/мкл
990 10 20 пг/мкл 10 пг/мкл
999 1 2 пг/мкл 1 пг/мкл
1000 0 0 0

Смешайте каждый стандартный раствор ДНК с рабочим раствором красителя в соотношении 1:1 (конечный объём образца (Vобразца) уточните в таблице выше). Перемешайте.

! При обнаружении нелинейности калибровочной кривой на границах динамического диапазона прибора скорректируйте концентрации стандартов для оптимального использования возможностей флуориметра.

4. Приготовление экспериментального образца.

Разведите исследуемый образец ДНК в 1х ТЕ буфере таким образом, чтобы объём образца составил 50% измеряемого объема (исходный объём образца может быть любым, однако конечная концентрация должна соответствовать диапазону 1 пг/мкл - 5 нг/мкл). Добавьте равный объем рабочего раствора красителя Pico488. Перемешайте.

5. Инкубируйте приготовленные растворы стандартов и экспериментального образца с красителем 5 минут при комнатной температуре.

6. Измерение флуоресценции.

Измерьте интенсивность флуоресценции стандартных растворов ДНК и экспериментальных образцов ДНК (краситель, связанный с молекулой двухцепочечной ДНК, имеет максимум поглощения при длине волны 503 нм и максимум испускания при 525 нм).

7. Расчёт концентрации ДНК

Постройте калибровочную кривую, используя данные об уровне флуоресценции стандартных растворов. Аппроксимируйте данные линейной функцией, найдите параметры функции A и B. Линейное уравнение зависимости флуоресценции (FL) от концентрации (C) выглядит следующим образом:

FL= A × C + B, где FL – интенсивность флуоресценции в условных единицах, а C – концентрация ДНК, A и B – параметры линейной функции.

Концентрация ДНК в экспериментальном образце:

Cобразца = (FLобразца – B)/A, где FLобразца – флуоресценция образца, A и B – параметры найденной линейной функции.

Концентрация ДНК в исходном образце:

Сисх = Vобразца × Cобразца/Vисх, где Vобразца – объём образца и Vисх – объем исходного раствора ДНК, использованный для приготовления экспериментального образца.

Для проведения необходимых вычислений мы рекомендуем воспользоваться нашими калькуляторами: для расчета концентрации ДНК и приготовления/разбавления растворов.

Пример уравнения зависимости флуоресценции от концентрации ДНК:

Наборы

Набор Pico488 для определения количества дцДНК

Набор для определения количества ДНК по флуоресценции. Для определения используется краситель Pico488. Набор содержит стандарт ДНК и буфер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1102-200 200 assays $350.00 в наличии
B1102 200 assays $395.00 в наличии

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.