Years on Market
20

Инструкция к набору LumiPure® UNI для выделения нуклеиновых кислот из биообразцов методом преципитации

Инструкция к LumiPure® UNI, набору для выделения нуклеиновых кислот из любых биообразцов методом преципитации. Набор предназначен для выделения тотальной нуклеиновой кислоты из широкого спектра биологических образцов.

Набор предназначен для выделения тотальной нуклеиновой кислоты из широкого спектра биологических образцов: тканей и органов растений и животных, плазмы крови, лейкоцитов, культур клеток млекопитающих и грамотрицательных бактерий, соскобов эпителиальных клеток, мазков, смывов и др. жидких образцов биологических жидкостей. Полученный препарат тотальной нуклеиновой кислоты подходит для последующего проведения ПЦР и ОТ-ПЦР.

Состав набора

Компонент набораКоличество
34663
100 assays
Буфер для растворения NA1
Лизирующий раствор NA1
Промывочный раствор 11
Промывочный раствор 21
Раствор для преципитации1

Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора:

  • Твердотельный термостат (возможно использование водяной бани);
  • Центрифуга с ротором для пробирок объёмом 1,5 мл со скоростью вращения не менее 13000 об/мин (11000 × g);
  • Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (1-2 пробирки для выделения из 1 образца);
  • Дополнительные материалы (в зависимости от образца):
    • ткани растений и животных: жидкий азот, ступка и пестик, вода
    • культуры клеток животных и бактерий: натрий-фосфатный буфер (PBS)
    • жидкие образцы, мазки и смывы, фекалии: стерильный физиологический раствор
    • мокрота: муколизин

Перед началом работы

При наличии осадка в лизирующем растворе NA прогрейте его в термостате до температуры не выше +50°С и дождитесь полного растворения осадка.

Подготовка образца

Ткани растений и животных

В качестве образца для выделения нуклеиновых кислот рекомендуется брать 20-30 мг ткани животного или растения. Для выделения могут использоваться как свежие, так и замороженные образцы тканей.

! Хранение образцов тканей при −70°С в течение нескольких месяцев.

  1. Поместите свежий или замороженный (−70°С) кусочек ткани в жидкий азот.
  2. Перенесите замороженный образец ткани в ступку и тщательно гомогенизируйте образец до состояния порошка.
  3. Пересыпьте порошок в отдельную пробирку объёмом 1,5 мл. Дождитесь испарения жидкого азота, при этом не позволяйте образцу оттаять.
  4. Добавьте к гомогенату (в указанном порядке): 300 мкл лизирующего раствора NA, 100 мкл воды. Перемешайте.
  5. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот», пункт 2.

Культуры клеток животных и бактерий

Для выделения нуклеиновых кислот данным набором рекомендуется брать не более 1-2 × 106 животных клеток и 109 клеток грамотрицательных бактерий.

Адгезионная культура клеток животных: удалите культуральную жидкость, снимите культуру клеток с поверхности пластика трипсином или другим рекомендованным для данной культуры методом. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 × g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую пробирку объёмом 1,5 мл.

Суспензионная культура клеток животных: отберите объём культуральной жидкости, содержащий необходимое число клеток. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 × g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую пробирку объёмом 1,5 мл.

Бактериальная культура: бактерии, выращенные на твердой или жидкой питательной среде, соберите центрифугированием в течение 5-10 минут, 3000-5000 × g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую пробирку объёмом 1,5 мл.

Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Плазма крови

Данный набор подходит для выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови. Для получения плазмы следует использовать образцы цельной периферической крови, содержащие в качестве антикоагулянта ЭДТА в конечной концентрации 2,0 мг/мл или цитрат натрия.

! Не допускается использовать гепарин в качестве антикоагулянта.

! Время от момента взятия периферической крови до получения плазмы не должно составлять более 6 часов.

  1. Перемешайте переворачиванием пробирку с кровью, чтобы содержимое пробирки стало гомогенным.
  2. Центрифугируйте пробирку с кровью 20 мин, 900 × g при комнатной температуре (+18-25°С).
  3. Отберите 100 мкл верхней фракции (плазмы) и перенесите в отдельную пробирку объёмом 1,5 мл.
  4. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

! Хранение плазмы при −20°С не более 3 месяцев.

Соскобы эпителиальных клеток

Данный набор подходит для выделения тотальной нуклеиновой кислоты из соскобов эпителиальных клеток, взятых с помощью одноразового стерильного зонда (буккального эпителия, с задней стенки глотки, носоглотки, из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища и т.д.).

  1. Внесите 500 мкл физиологического раствора (стерильного) в пробирку объёмом 1,5 мл.
  2. Тщательно промойте в физиологическом растворе зонд с соскобом эпителиальных клеток. Прижмите к стенке ватный тампон и вращательным движением отожмите из него остатки физиологического раствора.
  3. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Тщательно удалите супернатант.
  4. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  5. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Моча

  1. Внесите 1 мл образца мочи в чистую пробирку объёмом 1,5 мл.
  2. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Тщательно удалите супернатант.
  3. Ресуспендируйте осадок в 1 мл физиологического раствора (стерильного).
  4. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  5. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  6. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Слюна, ликвор, синовиальная жидкость

  1. Внесите 500 мкл образца в отдельную пробирку объёмом 1,5 мл.
  2. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант, оставив в пробирке около 50 мкл.
  3. Ресуспендируйте осадок в 500 мкл физиологического раствора (стерильного).
  4. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  5. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  6. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Сперма, секрет предстательной железы

  1. Внесите 100 мкл образца в отдельную пробирку 1,5 мл.
  2. Добавьте к образцу 500 мкл физиологического раствора (стерильного). Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 5-10 сек.
  3. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  4. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  5. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Мазки и смывы

  1. Поместите образец в пробирку для центрифугирования.
  2. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  3. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  4. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Фекалии

  1. Внесите 1 мл физиологического раствора (стерильного) в чистую пробирку объёмом 1,5 мл.
  2. Поместите в пробирку с физиологическим раствором около 250 мг (мкл) фекалий.
  3. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 5-10 сек.
  4. Центрифугируйте 3 мин, 100 × g.
  5. Перенесите 800-1000 мкл супернатанта в отдельную пробирку 1,5 мл.
  6. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  7. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  8. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Мокрота

  1. В контейнер с образцом добавьте муколизин в соотношении 5:1 (5 частей муколизина : 1 часть мокроты), ориентируясь по градуировке контейнера.
  2. Закройте крышку контейнера, встряхните содержимое пробирки и инкубируйте 20-30 мин при комнатной температуре, каждые 2-3 мин встряхивая контейнер.
    ! Обработанную мокроту допускается хранить в контейнере в течение суток при +4°С или долговременно при −20°С.
  3. Внесите 500 мкл полученного обработанного муколизином образца мокроты в отдельную пробирку объёмом 1,5 мл.
  4. Центрифугируйте 10 мин, 11000 × g. Удалите супернатант.
  5. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл физиологического раствора (стерильного).
  6. Переходите к разделу «Выделение нуклеиновых кислот».

Выделение нуклеиновых кислот

Работы следует выполнять при комнатной температуре, все центрифугирования (если иное прямо не оговорено) при скорости >13000 об/мин (>11000 × g).

Перед началом работы установите термостат на +65°С, поместите в него пробирку с буфером для растворения NA.

Подготовьте образец в объеме 100 мкл в пробирке объёмом 1,5 мл согласно разделу «Подготовка образца».

  1. В пробирку с образцом (100 мкл) добавьте 300 мкл лизирующего раствора NA, тщательно перемешайте содержимое пробирки на вортексе.
  2. Инкубируйте полученную смесь 15 мин при +65°С.
  3. (опционально) Если образец после лизиса содержит нерастворенные компоненты, центрифугируйте пробирку с образцом 10 мин. Перенесите супернатант в новую пробирку объёмом 1,5 мл.
  4. Добавьте к образцу 400 мкл раствора для преципитации, перемешайте на вортексе. Центрифугируйте 15 минут.
  5. Аккуратно удалите супернатант, не задевая осадок. К осадку добавьте 500 мкл промывочного раствора 1, перемешайте на вортексе. Центрифугируйте 5 мин.
  6. Аккуратно удалите супернатант, не задевая осадок. К осадку добавьте 500 мкл промывочного раствора 2, перемешайте на вортексе. Центрифугируйте 5 мин.
  7. Тщательно удалите супернатант, не задевая осадок. Подсушите осадок 5 минут в пробирке с открытой крышкой при +65°С.
  8. Добавьте 50 мкл предварительно прогретого до +65°С буфера для растворения NA.
  9. Инкубируйте пробирку с образцом 5-10 минут при +65°С. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе, сбросьте капли центрифугированием. Полученный препарат тотальной нуклеиновой кислоты готов для постановки реакции ПЦР/ОТ-ПЦР без дополнительной пробоподготовки.

Хранение выделенной РНК: Из-за нестабильности РНК выделенный образец хранить не рекомендуется. Полученный препарат РНК необходимо сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции.

Хранение выделенной ДНК: кратковременно при +4°С, долговременно при −20°С не более одного месяца или при −70°С не более одного года.