Инструкция к набору для выделения плазмидной ДНК (spin-miniprep до 30 мкг)

Данный набор предназначен для быстрого выделения высокоочищенной плазмидной ДНК (до 30 мкг) из культуры клеток Escherichia coli на spin-колонках. Очищенная плазмидная ДНК пригодна для любых молекулярно-биологических работ.

Состав набора:

Название компонента Количество
10 выделений 50 выделений
Раствор для ресуспендирования 5 мл 15 мл
РНКаза А (10 мг/мл) 50 мкл 150 мкл
Лизирующий раствор 7.5 мл 15 мл
Нейтрализующий раствор 3 мл 15 мл
Промывочный раствор (с Гуанидиний хлоридом) 6 мл 30 мл
Промывочный раствор (концентрат для добавления EtOH) 10 мл 20 мл
Элюирующий раствор 2 мл 10 мл
Колонки с сорбентом 10 шт 50 шт
Пробирки для сбора проскока 10 шт 50 шт

Хранить при комнатной температуре. Срок хранения — 1 год.

Протокол выделения плазмидной ДНК.

Перед началом работы: Добавьте в ресуспендирующий раствор РНКазу А, перемешайте (для более полного переноса РНКазы А следует омыть пробирку с РНКазой А небольшим количеством ресуспендрующего раствора); добавьте к 10 мл концентрата промывочного раствора 40 мл этанола, перемешайте. Поставьте отметки на крышках сосудов с ресуспендирующим и промывочным растворами.

Убедитесь в отсутствии осадка в лизирующем и нейтрализующим растворах, при наличии осадка подогрейте до 50°С на водяной бане до полного растворения осадка.

Не используйте для выделения более 30 ОЕ культуры (например 15 мл при плотности культуры на 600 нм 2OE). В случае необходимости использовать большее количество клеток для выделения плазмиды, следует кратно увеличить объемы ресуспендирующего, лизирующего и нейтрализующего растворов, и соответственно несколько раз наносить надосадочную жидкость на колонку.

  1. 2.5-7 мл ночной культуры бактерий (10-15 мл для низкокопийных плазмид) центрифугировать на 5 000 об/мин (4500g) 5 мин (или на 13000 об/мин (<10000g) 1 мин).
  2. Осадок, хорошо очищенный от культуральной жидкости, тщательно ресуспендировать в 250 мкл раствора для ресуспендирования и перенести в 1.5 мл пробирку.
  3. К суспензии клеток добавить 250 мкл лизирующего раствора, аккуратно перемешать путем переворачивания пробирки около 6 раз (в случае использования 10-15 мл культуры 5 перемешиваний инвертированием может не хватить. В этом случае следует еще несколько раз резко перевернуть содержимое.  В то же время нельзя использовать вортекс для перемешивания. Раствор после этого шага не должен быть мутным. Он должен быть полупрозрачным и вязким.).
  4. Добавить 350 мкл нейтрализующего раствора, аккуратно перемешать путем переворачивания пробирки 10 раз (в случае использования 10-15 мл культуры после перемешивания необходимо несколько секунд встряхнуть содержимое пробирок. После этого этапа в пробирке должны плавать белые хлопья).
  5. Центрифугировать 5 мин, 10 000 - 13 000 об/мин.
  6. Колонки поместить в пробирки для сбора проскока. Надосадочную жидкость нанести на колонку.
  7. Центрифугировать 30 - 45 сек, 10 000 - 13 000 об/мин. Проскок с колонки вылить.
  8. Опционально. Для полного удаления нуклеаз при выделении из end A+ штаммов и удаления эндотоксинов нанести на колонку 500 мкл промывочного раствора с гуанидиний хлоридом (Использование этого раствора может приводить к 20% снижению выхода.). Центрифугировать 60 сек, 10 000 - 13 000 об/мин. Проскок с колонки вылить.
  9. Нанести на колонку 500 мкл промывочного раствора 1. Центрифугировать 30 - 45 сек, 10 000 -13 000 об/мин. Проскок с колонки вылить. Повторить промывку, описанную в данном пункте, еще один раз.
  10. После удаления проскока поместить пустые колонки в пробирках для сбора проскока в центрифугу и центрифугировать 30 - 45 сек, 10 000 - 13 000 об/мин.
  11. Колонки поместить в новые 1.5 мл пробирки, нанести в центр фильтра колонки 50-100 мкл элюирующего раствора (при элюции 100 мкл — выход максимален, при элюции 50 мкл максимальна концентрация), инкубировать 1 мин при комнатной температуре. Центрифугировать 2 мин, 10 000 - 13 000 об/мин.

Также важно!
При измерении концентрации ДНК на кюветном спектрофотометре следует развести образец ДНК в 10-20 раз буфером TE с pH 8,5  или элюирующим раствором (не используйте воду), иначе измерения будут неточными.

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.