Мечение белков с помощью пирилиевых красителей

Пирилиевые красители — флуорогенные, реакционноспособные по отношению к первичным аминам красители, образующие флуоресцентные продукты после конъюгации с первичными аминогруппами пептидов, белков и других биомолекул.

В свободном состоянии пирилиевые красители практически не обладают флуоресценцией, однако, их квантовый выход возрастает в десятки раз после конъюгации с первичными аминами. Одновременно с этим наблюдается коротковолновый спектральный сдвиг флуоресценции красителя. Сдвиг спектров возбуждения/испускания и повышение квантового выхода после конъюгации способствуют значительному снижению фона от несвязанного красителя. Несвязанный краситель также гидролизуется во время процедуры мечения. Все это позволяет метить молекулы, содержащие амины, с помощью простой одноэтапной инкубации при комнатной температуре без каких-либо дополнительных этапов очистки.

Меченные пирилиевыми красителями пептиды и белки готовы к использованию сразу после конъюгации. Поэтому они могут быть использованы в таких приложениях, как гель-электрофорез с SDS, капиллярный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и др. Пирилиевые красители также используют в качестве флуоресцентной метки в исследованиях связывания рецепторов.

Ниже приводится типовой протокол для мечения белков с помощью пирилиевых красителей.

Приготовление растворов

Приготовление стокового раствора красителя
1. Растворите 1 мг красителя в 100 мкл диметилформамида.
  Важно! Не используйте в качестве растворителя аминосодержащие растворы или буферы.
2. Стоковый раствор можно хранить в темноте при температуре 4 °C в течение 6 месяцев.
Приготовление 0,1 М бикарбонатного буфера (pH 8,3)
1. Растворите 4,2 г NaHCO₃ в 500 мл бидистиллированной воды.
2. Доведите буфер до pH 8,3 с помощью 1 N NaOH.
Приготовление 22 мМ фосфатного буфера (pH 7,2)
1. Растворите 5,67 г Na₂HPO₄×12H₂O и 0,96 г NaH₂PO₄×2H₂O в 1 л бидистиллированной воды.
2. Доведите буфер до pH 7,2 с помощью 1 N HCl.

Мечение белков

Растворите 2 мг белка в 0,5 мл бикарбонатного буфера (pH 8,3).
Добавьте по каплям 5–10 мкл рабочего раствора пирилия-1, -4 или -6 к раствору белка.
Добавьте по каплям 10–20 мкл рабочего раствора пирилия-8 к раствору белка.
Осторожно перемешивайте реакционную смесь при комнатной температуре в течение указанного времени:
- 30 мин — для пирилия-1;
- 1 ч — для пирилия-4 и -6;
- 2 ч — для пирилия-8.
Важно! Краситель проявляет высокую реакционную способность в диапазоне pH от 8,0 до 9,0.
При инкубации в основной среде реакционная смесь поменяет цвет с синего (пирилий-1), фиолетового (пирилий-4) или пурпурного (пирилий-6) на желтый.
Несвязанный краситель гидролизуется во время процедуры мечения, поэтому меченные пирилиевыми красителями пептиды и белки готовы к использованию сразу после конъюгации.

Очистка конъюгированного белка

Для некоторых применений может потребоваться очистка конъюгированного с красителем белка.

Меченый белок очищается с помощью гель-хроматографии с использованием Sephadex G25 в качестве неподвижной фазы и 22 мМ фосфатного буфера (pH 7,2) в качестве элюента. Красная полоса указывает на меченый белок.