Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора

• Автоматическая рабочая станция (KingFisher™ Flex, Allsheng Autopure, Nexor, Bioer (GenePure Pro 96), MagMAX™ Express-96, KingFisher™ Duo Prime, KingFisher™ mL, или другая станция, совместимая с наборами для выделения на магнитных частицах, либо магнитный штатив;
• При использовании магнитного штатива: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (2 пробирки для выделения НК из одного образца);
• Натрий-фосфатный буфер (PBS) для выделения НК из соскобов эпителия;
• Шейкер для планшетов (опционально);
• Расходный пластик при использовании автоматической рабочей станции;
• Раствор лизоцима 100 мг/мл (дополнительно, при выделении НК из грамположительных бактериальных культур (например, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus)) (набор для предобработки образцов лизоцимом перед выделением ДНК (лиофилизированный), LysoPrep Lyo (артикул 21133) Вы можете приобрести отдельно).

Перед началом работы

• При наличии осадка в Лизирующем растворе UNI и Промывочном растворе А UNI прогрейте их в термостате до температуры не выше 50°С, периодически встряхивая, и дождитесь полного растворения осадка.
• В случае использования шейкера для планшетов автоматизированных станций, подберите оптимальные условия для эффективного перемешивания:
  • Убедитесь, что планшет плотно фиксируется в шейкере.
  • Добавьте в лунки планшета 1 мл воды и накройте планшет фольгой.
  • Определите максимальную скорость шейкера, при которой вода из лунок не выплескивается на фольгу.

Подготовка исследуемого материала

Цельная кровь

Тщательно перемешайте пробирку с кровью и используйте 100 мкл в качестве образца.

Плазма

1. Перемешайте переворачиванием пробирку с цельной кровью (используйте пробирки с K₂EDTA или CPDA).

1. Центрифугируйте 20 мин при 900× g при комнатной температуре.
2. Аккуратно отберите верхнюю фракцию; перенесите 100 мкл плазмы в чистую пробирку 1,5 мл.
3. Немедленно переходите к лизису и сорбции; при необходимости храните плазму при −20°C до 3 мес.

Лейкоциты (лейкоформенный слой или осадок)

1. Получите лейкоцитарную фракцию стандартным методом.
2. Осадите клетки центрифугированием 5 мин при 300× g, удалите супернатант полностью.
3. Ресуспендируйте осадок в PBS до объёма 100 мкл; при высокой вязкости сделайте дополнительную промывку PBS.
4. Держите на льду и переходите к этапу выделения НК.

Соскобы эпителия

1. Добавьте в чистую 1,5 мл пробирку 1 мл PBS.
2. Тщательно промойте зонд для забора проб с соскобом эпителия в PBS.
3. Отрежьте верхнюю часть зонда, закройте пробирку.
4. Перемешайте на вортексе в течение 2–3 мин. В качестве образца используйте 100 мкл супернатанта.

Культуры клеток млекопитающих (адгезионные и суспензионные)

1. Подготовьте клетки. Для адгезионных культур: удалите среду, снимите клетки трипсином или рекомендованным методом.
2. Перенесите суспензию в пробирку 1,5–2 мл. Используйте не более 1–5×10⁶ клеток на выделение.
3. Осадите клетки центрифугированием 5 мин при 300× g. Удалите супернатант, избегая потери осадка.
4. Ресуспендируйте осадок в PBS до объёма 100 мкл. При высокой вязкости промойте образец PBS ещё раз и снова ресуспендируйте в 100 мкл.
5. Проверьте однородность пипетированием и перемешайте вортексированием в течение 5–10 с.
6. Оставьте суспензию на льду до перехода к лизису. Не допускайте хранения образца более 30 мин без стабилизатора.
7. Перейдите к этапу выделения НК.

Грамотрицательные бактерии (например, E. coli)

1. Перенесите 0,5–2,0 мл ночной культуры (не более 1×10⁸ клеток) в пробирку 1,5–2 мл.
2. Осадите центрифугированием 1 мин при 10000× g, аккуратно удалите супернатант.
3. Ресуспендируйте осадок в 200 мкл PBS, добейтесь полной однородности пипетированием.
4. При необходимости повторите пп. 2–3.
5. Отберите 100 мкл полученной суспензии для одного выделения и сразу переходите к этапу выделения НК.

Грамположительные бактерии (например, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus)

• Возьмите 0,5–2,0 мл ночной культуры (до 1×10⁸ клеток), центрифугируйте 1 мин при 10 000× g, удалите супернатант.
• Ресуспендируйте осадок в 200 мкл PBS.
• Внесите 40 мкл раствора лизоцима (100 мг/мл).
• Перемешайте вортексированием 5–10 с, инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
• Опционально для труднолизируемых штаммов используйте:
  • Lysostaphin до 25–50 мкг/мл для Staphylococcus spp. дополнительно 10 мин при комнатной температуре.
  • Mutanolysin 250–500 ЕД/мл для Streptococcus spp. 10 мин при комнатной температуре.
• Перемешайте вортексированием 5–10 с, убедитесь в однородности суспензии; при необходимости промойте образец PBS и снова приведите его объём к 200 мкл.
• Отберите 100 мкл подготовленной суспензии и сразу переходите к этапу выделения НК.

Ткани животных

1. Отберите 20–30 мг ткани; для селезёнки используйте не более 10–15 мг.
   Для свежих и замороженных тканей: держите образец охлаждённым; избегайте частичного оттаивания до гомогенизации.
   Образцы с плотной структурой необходимо предварительно разрезать на мелкие фрагменты.
2. Гомогенизируйте образец в соответствии с инструкцией к выбранному типу ткани:

   Вид гомогенизации	Описание
   Криогомогенизация	Поместите образец в жидкий азот, измельчите в порошок в охлажденной ступке, быстро перенесите в пробирку объемом 1,5 мл, дождитесь испарения азота, не допуская оттаивания.
   Пестик	Перенесите ткань в пробирку 1,5 мл и добавьте 200 мкл PBS, тщательно перетрите одноразовым пестиком до однородной суспензии.
   Механический гомогенизатор	Добавьте 200 мкл PBS, измельчите на механическом гомогенизаторе до однородности в соответствии с инструкцией механического гомогенизатора для выбранного вида ткани.

3. Полученный гомогенат доведите PBS до 200 мкл, аккуратно перемешайте, удалите нерастворимые крупные фрагменты кратким осаждением в течение 10 с на 1000× g при необходимости.
4. Держите на льду; немедленно переходите к этапу выделения НК.

Примечание:
Допускается хранение ткани в стабилизаторе РНК. В этом случае, перед гомогенизацией извлеките ткань из стабилизатора, обсушите ее от избытка раствора, и далее выполните шаги 3–5.

Выделение НК с использованием магнитного штатива

1. Тщательно ресуспендируйте суспензию магнитных частиц переворачиванием пробирки до визуального достижения однородности и отсутствия осадка. Далее перед каждым взятием суспензии магнитных частиц, перемешивайте их пипетированием.
2. Внесите в пробирки по 400 мкл Лизирующего раствора UNI и 20 мкл магнитных частиц (100 мг/мл).
3. Тщательно перемешайте биоматериал на вортексе в течение 10 с и внесите по 100 мкл в пробирки с Лизирующим раствором UNI и магнитными частицами.
4. Тщательно перемешайте содержимое пробирок на вортексе в течение 10 с, сбросьте капли.
5. Инкубируйте пробирки 10–15 мин при комнатной температуре. В процессе инкубации периодически перемешивайте их на вортексе в течение 10 с.
6. Поместите пробирки в магнитный штатив, подождите 1 мин.
7. Не вынимая пробирки из магнитного штатива, удалите супернатант.
8. Добавьте 700 мкл Промывочного раствора A UNI, тщательно перемешайте содержимое на вортексе в течение 10 с, сбросьте капли.
9. Поместите пробирки в магнитный штатив, подождите 1 мин, удалите супернатант.
10. Добавьте 700 мкл Промывочного раствора B UNI, тщательно перемешайте содержимое на вортексе в течение 10 с, сбросьте капли.
11. Поместите пробирки в магнитный штатив, подождите 1 мин, удалите супернатант.
12. Повторите пп. 6–7.
13. Подсушите пробирки в твердотельном термостате в течение 5 мин при 60°C.
14. Добавьте 50 мкл Элюирующего раствора, тщательно перемешайте содержимое на вортексе в течение 20 с и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
15. Сбросьте капли, поместите пробирки в магнитный штатив, подождите 1 мин.
16. Перенесите супернатант в новые пробирки.

Выделение НК с использованием автоматической рабочей станции с методом магнитной сепарации

Пробоподготовка выполняется вне станции выделения.

1. Создайте программу для выделения НК в соответствии с протоколом из раздела «Выделение НК с использованием магнитного штатива».
2. В зависимости от типа используемой станции распределите глубоколуночные планшеты/ряды лунок планшетов по этапам выделения. Этапами выделения считаются: лизис, 3 промывки, элюция.
   1. В планшет/ряды для лизиса внесите 400 мкл Лизирующего раствора UNI, 20 мкл магнитных частиц (предварительно перемешайте магнитные частицы переворачиванием), 100 мкл биоматериала после пробоподготовки.
   2. В планшет/ряды для промывки 1 внесите 700 мкл Промывочного раствора A UNI.
   3. В планшет/ряды для промывки 2 внесите 700 мкл Промывочного раствора B UNI.
   4. В планшет/ряды для промывки 3 внесите 700 мкл Промывочного раствора B UNI.
   5. В планшет/ряды для элюции внесите 50 мкл Элюирующего раствора.
3. Установите все необходимые расходные материалы и планшеты с растворами в соответствующие позиции станции выделения.
4. Запустите выполнение протокола на станции выделения.

Хранение выделенных НК

• Хранение выделенной ДНК: долгосрочное при −20°С; кратковременное (до 1 недели) при 4°С.
• Если целью выделения является РНК, реакцию обратной транскрипции (или ОТ-ПЦР в одной пробирке) рекомендуется ставить непосредственно после выделения, не допуская ее длительного хранения. В случае необходимости допускается заморозка и хранение препарата РНК, однако при этом будут происходить потери и фрагментация РНК.

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ

Введено некорректное число товаров для добавления.