Реакционная смесь для кПЦР all-in-one, 2x (с добавлением dsGreen, ROX, UDG)
Смесь для кПЦР all-in-one подходит для точного определения содержания ДНК матрицы в пробе и может применяться для определения копийности и уровня экспрессии генов, генотипирования и др. методом кПЦР. Готовая 2-х кратная реакционная смесь содержит все необходимые компоненты для проведения количественной ПЦР, ее состав оптимизирован для получения идеальных результатов с минимальным значением порогового цикла и высоким уровнем отношения сигнал/фон. Полимераза с технологией «горячего старта» предотвращает неспецифическую амплификацию, а урацил-ДНК-гликозилаза исключает кросс-контаминацию и получение ложноположительных результатов. Для детекции используется интеркалирующий краситель dsGreen в присутствии референсного красителя ROX. Объем смеси 1 мл рассчитан на проведение 100 реакций объемом 20 мкл.
Состав реакционной смеси: HS Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (включая dUTP), урацил-ДНК-гликозилаза (UDG), ПЦР-буфер (содержит Mg2+), интеркалирующий краситель dsGreen, референсный краситель ROX
Совместимость с оборудованием: совместима с большинством real-time амплификаторов, в том числе производства Applied Biosystems (7300, 7500, 7500 Fast, 7900HT, QuantStudio 12k Flex,QuantStudio 3, QuantStudio 5, QuantStudio 6 Flex, QuantStudio 7, StepOne, StepOnePlus, ViiA 7 System), Bio-Rad (CFX384, CFX 96, iQ5), Roche (LC 480), Stratagene (MX3000P, MX3005P, MX4000) и др.
Протокол
- Разморозьте реакционную смесь, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.
- Смешайте компоненты реакции согласно приведённой ниже таблице в указанной последовательности из расчёта на (N+0,1N) реакций, где N — необходимое число реакций. Готовую смесь перемешайте и сбросьте капли
центрифугированием.
! Для получения воспроизводимых результатов реакцию рекомендуется ставить в 2 и более
повторах для каждого образца ДНК.
! Объем реакции может варьироваться в зависимости от конкретной задачи, однако объем реакции
менее 10 мкл не рекомендуется.
Расчет на 1 реакцию объемом 20 мкл:
* при использовании другого объема реакции следует пересчитать объемы компонентов реакции с сохранением приведенных пропорций
Компонент Объем Примечание 2х Реакционная смесь all-in-one 10 мкл — Прямой праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора 5–15 пмоль/реакцию (конечная концентрация 250–750 нМ) Обратный праймер 0.5–1.5 мкл 10 мкМ раствора Деионизованная вода Добавляется до общего объема реакции 20 мкл ДНК 2–9 мкл
(кДНК, 50–100 нг геномной ДНК, 1–100 пг плазмидной ДНК)Добавляется отдельно в каждую пробирку (см. п.3) Общий объём реакции 20 мкл* - В пробирки для ПЦР внесите готовую смесь без учета объема образца ДНК. Образцы ДНК внесите отдельно в каждую пробирку, сбросьте капли центрифугированием.
Программа амплификации:
Для расчёта температуры плавления (Tm) праймеров рекомендуется использовать стандартные инструменты, работающие по алгоритму Nearest-Neighbor (SantaLucia J Jr., 1998). Температура отжига праймеров рассчитывается по формуле Ta=Tm-5 °С.
- Если температура отжига праймеров ≥60 °С
Стадия Температура Время Число циклов Активация урацил-ДНК-гликозилазы 50 °С 5 мин 1 Активация HS Taq-полимеразы 95 °С 5 мин 1 Денатурация 95 °С 10 сек 40 Отжиг праймеров, совмещенный с элонгацией
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)60–72 °С 30–60 сек - Если температура отжига праймеров <60 °С
Стадия Температура Время Число циклов Активация урацил-ДНК-гликозилазы 50 °С 5 мин 1 Активация HS Taq-полимеразы 95 °С 5 мин 1 Денатурация 95 °С 10 сек 40 Отжиг праймеров
(На этом этапе должна производиться детекция флуоресценции)55–59 °С 10–15 сек Элонгация 72 °С 15–30 сек
! После проведения амплификации, для того чтобы убедиться в отсутствии неспецифической амплификации, рекомендуется провести плавление ампликона в диапазоне от 60 до 95 °С.
Корзина пуста
$ 
