Оценка клеточной пролиферации и репликации ДНК методом клик-химии

Методы количественной оценки пролиферации клеток широко используются в исследованиях цитотоксичности, онкологических исследованиях и многих других областях клеточной биологии. Многие из них позволяют визуализировать пролиферирующие клетки с помощью флуоресцентных красителей и могут быть использованы для проведения скрининга с высокой пропускной способностью.

Обнаружение реплицированной ДНК является одним из наиболее прямых способов выявления клеточной пролиферации. Для этого чаще всего используют бромодезоксиуридин (BrdU) — нуклеозид, который встраивается в ДНК во время ее репликации. Содержащая BrdU ДНК обнаруживается затем с помощью антител против этого нуклеозида. Несмотря на свою специфичность, данный метод выявления клеточной пролиферации отличается трудоемкостью и сложностью реализации, поскольку включает обработку клеток агрессивными реагентами, обеспечивающими экспонирование ДНК для связывания с антителами против BrdU, и проникновение указанных антител внутрь клетки.

Более мягкой альтернативой является использование другого нуклеозида — этинилдезоксиуридина (EdU), который может быть доставлен в клетку путем его добавления в питательную среду культуры, а также путем инъекции животным. После встраивания в ДНК этот нуклеозид может быть конъюгирован с азидами различных флуоресцентных красителей при катализе медью(I), что обеспечивает флуоресцентное окрашивание реплицированной ДНК. Эта методика достаточно проста, отличается быстротой и легкостью реализации. Она не требует обработки клеток агрессивными реагентами (нужна только их пермеабилизация Тритоном) и поэтому обеспечивает лучшую сохранность клеточных структур. После обработки азидом красителя и последней отмывки (этап 8) клетки можно пометить с помощью реагентов, содержащих флуорофоры с различной длиной волны эмиссии, таких как Hoechst, DAPI или антител с флуоресцентной меткой.

Необходимые реагенты

Протокол

Точный протокол зависит от конкретного типа клеток или ткани. В общем он может быть описан следующим образом:

  1. Обработайте клетки/ткань добавлением 10–20 мкM EdU в питательную среду в течение определенного времени.
  2. Зафиксируйте клетки в 3,7% растворе формальдегида в PBS в течение 15 мин.
  3. Отмойте клетки с помощью PBS.
  4. Пермеабилизируйте клетки в PBS, содержащем 0,2% Triton X-100 (или 0,5% Tween-20), в течение 30 мин.
  5. Отмойте клетки с помощью PBS еще раз.
  6. Приготовьте смесь, содержащую 2 мM Cu(II)-BTTAA комплекса, 5 мкM азида красителя и 10 мМ аскорбиновой кислоты в 100 мМ Трис-буфере, pH 7,4 (для сульфированных азидов) или в 100 мМ Трис-буфере, pH 7,4, содержащем 50% ДМСО (для несульфированных азидов). Смесь должна быть свежеприготовленной из-за нестабильности меди(I) в растворе.
  7. Инкубируйте клетки в реакционной смеси в течение 30 мин.
  8. Отмойте клетки с помощью PBS.
  9. (Опционально) Если клетки необходимо пометить другим флуорофором, далее для окрашивания используйте ваш стандартный протокол.

Использование сульфированных (водорастворимых) азидов — азидов сульфоцианинов и AF красителей, дает наилучшие результаты. При использовании несульфированных азидов — азидов цианинов и BDP, реакционная смесь должна содержать 50% ДМСО.

Ссылки

1. Ranall, M.; Gabrielli, B.; Gonda, T. Adaptation and validation of DNA synthesis detection by fluorescent dye derivatization for high-throughput screening. BioTechniques, 2010, 48(5), 379-386. doi: 10.2144/000113410

Похожие товары

BrdU (5-бромо-2'-дезоксиуридин)

BrdU - синтетический аналог тимидина для изучения синтеза ДНК de novo и пролиферации клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
3478-100mg 100 mg –   в наличии
3478-1g 1 g $125 в наличии
3478-5g 5 g $450 в наличии
Запросить образец
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

Cu(II)-BTTAA комплекс

Катализатор для проведения катализируемой медью клик-реакции в водной среде. Стабильный комплекс меди (II) с BTTAA, который должен быть переведен в одновалентную медь (I) с помощью восстановителей. Комплекс можно использовать для приготовления реакционного буфера любого состава.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
10050 1 mL $80 в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин)

EdU - нуклеозид с алкиновой группой, который включается клеточными ферментами в реплицируемую ДНК. После этого ДНК дочерних клеток можно проявить посредством конъюгации алкиновых групп с азидами флуоресцентных красителей в присутствии медного катализатора, и тем самым детектировать пролиферацию клеток.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A0540 5 mg –   в наличии
10540 100 mg $120 в наличии
20540 250 mg $195 в наличии
30540 500 mg $345 в наличии
40540 1 g $590 в наличии
60540 5 g по запросу в наличии
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.