Инструкция к набору для определения апоптоза и митохондриального мембранного потенциала

Mitochondrial Membrane Potential Apoptosis Kit — готовый к работе набор, предназначенный для быстрого и удобного анализа двух ключевых показателей апоптоза: экстернализации фосфатидилсерина (с помощью аннексина V-AF 488) и изменений потенциала митохондриальной мембраны (с помощью LumiTracker^® Mito Red CMXRos).

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V часто используется для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС), который на ранних стадиях апоптоза перемещается со внутренней стороны клеточной мембраны во внешнюю. Настоящий набор содержит рекомбинантный аннексин V, конъюгированный с AF 488, — ярким фотостабильным зеленым флуорофором со спектральными характеристиками, аналогичными FITC.

LumiTracker Mito Red CMXRos — катионный красный флуоресцентный краситель, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и избирательно накапливается в активных митохондриях в зависимости от мембранного потенциала в них. Здоровые клетки обладают высоким митохондриальным мембранным потенциалом, и его снижение считают маркером ранней стадии апоптоза.

После окрашивания аннексином V-AF 488 и красителем LumiTracker^® Mito Red CMXRos живые клетки будут иметь слабую зеленую и интенсивную красную флуоресценцию; апоптотические клетки, наоборот, будут обладать высокой зеленой и низкой красной флуоресценцией. Эти две популяции клеток легко различаются с помощью проточного цитометра, при этом оба красителя способны возбуждаться линией 488 нм аргоно-ионного лазера.

Набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотичеких клеток конъюгатом аннексина V с AF 488 и определения митохондриального мембранного потенциала с помощью красителя LumiTracker^® Mito Red CMXRos.

Состав набора

Компонент набора	Количество
Компонент набора	21372 50 assays
21515, Аннексин V-AF 488 конъюгат, 5 ug	1
83215, Буфер для связывания аннексина V, 5×, 15 mL	1
15050, ДМСО (диметилсульфоксид) для мечения, 1 mL	1
2251-50ug, LumiTracker® Mito Red CMXRos, 50 ug	3

Транспортировка: при комнатной температуре в течение 1 недели. Хранить при -20°С 9 месяцев.

Срок хранения 9 месяцев.

Прежде чем начать

Обычно используемая концентрация LumiTracker^® Mito Red CMXRos для окрашивания клеток составляет 25–500 нМ. Рабочее разведение зависит от типа и плотности клеток и должно быть определено экспериментально.
Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF — от 2 до 10 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF для определения оптимальной концентрации.
Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Приготовление растворов

Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF (21515) в 250 мкл деионизованной воды.
Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!
Приготовьте необходимый объём 1× буфера для связывания, смешав 1 часть 5× буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.
Приготовьте 10 мМ стоковый раствор красителя LumiTracker^® Mito Red CMXRos, добавив 9,4 мкл ДМСО (15050) в пробирку с красителем LumiTracker^® Mito Red CMXRos (2251-50ug). Неиспользованную часть стокового раствора можно хранить при температуре ≤—20°C до 1 мес.
Приготовьте 10 мкМ рабочий раствор красителя LumiTracker^® Mito Red CMXRos. Для этого добавьте пипеткой 1 мкл 10 мМ стокового раствора LumiTracker^® Mito Red CMXRos в 1000 мкл среды.

Окрашивание клеток

Индуцируйте апоптоз в клетках необходимым способом. Подготовьте отрицательный контроль, инкубируя клетки в отсутствие индуцирующего агента. Подготовьте положительный контроль некроза, инкубируя клетки с 2 мМ перекисью водорода в течение 4 ч при 37°C.
Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
Отберите 1 мл суспензии клеток (от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями: (1) неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); (2) клетки, окрашенные только аннексином V-AF; (3) клетки, окрашенные только LumiTracker^® Mito Red CMXRos (для настройки компенсации); а также пробирку (4) с экспериментальными клетками (двойная окраска аннексином V-AF и LumiTracker^® Mito Red CMXRos).
В пробирки (3) и (4) добавьте по 4 мкл 10 мкМ раствора LumiTracker Mito Red CMXRos, хорошо перемешайте.
Инкубируйте клетки в темноте в течение 15–45 мин в условиях, необходимых для данного типа клеток.
Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН 7,4) и один раз 1× буфером для связывания.
Ресуспензируйте клетки в 100 мкл холодного 1× буфера для связывания.
В пробирки (2) и (4) добавьте по 5-10 мкл раствора аннексина V-AF, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.

Проточная цитометрия

Для цитофлуориметрического анализа апоптоза клеток с помощью аннексина V-AF и LumiTracker^® Mito Red CMXRos помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли (см. выше).
Анализ связывания аннексина V-AF 488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.
Анализ клеток, окрашенных LumiTracker^® Mito Red CMXRos, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.
Для корректного разведения красителей по разными каналам детекции может потребоваться отдельная настройка компенсации.

Флуоресцентная микроскопия

Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
(Опционально) Клетки после окрашивания и перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя соответствующий набор фильтров.

Наборы

Набор для определения апоптоза и митохондриального мембранного потенциала с помощью LumiTracker® Mito Red CMXRos и аннексина V-AF 488

Готовый к использованию набор для анализа двух ключевых показателей апоптоза: экстернализации фосфатидилсерина и изменений потенциала митохондриальной мембраны.

Показать цены