Мечение клеток, экспрессирующих гибридные белки HaloTag®, с помощью лигандов HTag

Прежде чем начать

Приведённые ниже протоколы предназначены для окрашивания и анализа клеток, экспрессирующих гибридные белки HaloTag®. Перед мечением высейте клетки с требуемой плотностью, используя стандартную культуральную среду, оптимальную для данной линии. Для трансфекции следуйте инструкциям производителя трансфекционного реагента.

Примечание: клетки, культивированные до очень высокой плотности (т.е. до конфлюэнтного монослоя), могут давать повышенный фон при мечении.

Обращение и хранение

  • Лиганды HTag поставляются в лиофилизированном виде по 150 нмоль в пробирке. Реагенты могут храниться при −20°C до двух лет после получения.
  • Непосредственно перед окрашиванием приготовьте стоковый раствор лиганда. Для этого добавьте 150 мкл ДМФА или ДМСО к содержимому пробирки 150 нмоль и перемешайте на вортексе.
  • После растворения стоковые растворы следует хранить при −20°C, защищая от света и влаги.

Протокол

A. Быстрое мечение живых клеток

  1. Непосредственно перед использованием разбавьте стоковый раствор HTag в соотношении 1:200 в тёплой культуральной среде. Полученное разведение соответствует 5× рабочему раствору.
  2. Для мечения клеток замените 1/5 объёма культуральной среды на 5× рабочий раствор HTag. Аккуратно перемешайте.
  3. Инкубируйте клетки с HTag в течение 15 минут при 37°C в CO₂-инкубаторе для клеточных культур.
  4. Дважды замените среду, содержащую лиганд, равным объёмом тёплой свежей среды. Поскольку лиганды AF HTag не проникают в клетки, отмывка для удаления несвязанного лиганда не требуется.
  5. Перенесите образцы под микроскоп и выполните съемку.

Б. Pulse-chase мечение клеток

Данный протокол позволяет исследовать оборот или транспорт гибридных белков HaloTag®, методом pulse-chase мечения.

  1. Непосредственно перед использованием приготовьте 5× раствор лиганда для pulse-мечения разбавлением стокового раствора HTag в соотношении 1:200 в тёплой культуральной среде.
  2. Для мечения клеток замените 1/5 объёма культуральной среды на 5× раствор HTag. Аккуратно перемешайте.
  3. Инкубируйте клетки с лигандом для pulse-мечения в течение 15 минут при 37°C в CO₂-инкубаторе.
  4. Если этап chase следует сразу после pulse-мечения, переходите непосредственно к шагу 5. В противном случае замените среду, содержащую лиганд, равным объёмом тёплой свежей культуральной среды и либо выдержите необходимое время перед этапом chase, либо выполните запланированные биологические процедуры перед переходом к шагу 6.
  5. Непосредственно перед использованием приготовьте разведение лиганда для chase-мечения в соотношении 1:1000 (1× рабочий раствор) в теплой культуральной среде. Аккуратно замените среду равным объёмом 1× раствора для chase-мечения.
  6. Инкубируйте клетки с лигандом для chase-мечения в течение 15 минут при 37°C в CO₂-инкубаторе.
  7. Дважды замените среду, содержащую лиганд, равным объёмом тёплой свежей среды.
  8. Поместите образцы под микроскоп и выполните съемку.

В. Фиксация клеток после мечения

Ковалентная связь между лигандом и белком HaloTag® позволяет проводить последующую фиксацию, пермеабилизацию и отмывки клеток в стандартных условиях без значительной потери специфического флуоресцентного сигнала.

  1. Пометьте клетки с использованием лиганда AF HTag, следуя шагам 1–3 раздела A (Быстрое мечение) или шагам 1–6 раздела Б (Pulse-chase мечение).
  2. Замените среду равным объёмом 4% параформальдегида в 1× PBS (pH 7,5) и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  3. Замените фиксатор равным объёмом 0,1% Triton X-100 в 1× PBS и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Замените раствор детергента равным объёмом 1× PBS, затем либо перенесите образцы под микроскоп и выполните съемку, либо храните при 4°C, либо перейдите к разделу Г для проведения иммунноцитохимии.

Г. Иммунноцитохимия

Фиксированные клетки после мечения лигандом HTag можно дополнительно окрасить иммуноцитохимически любым интересующим антителом. Описанные процедуры можно использовать в качестве отправных. Протокол для конкретного антитела может отличаться, поэтому необходимо придерживаться инструкций его производителя.

  1. Замените 1× PBS равным объёмом блокирующего раствора (2% нормальной сыворотки от хозяина того же вида, что и для вторичного антитела, и 0,1% Triton X-100 в 1× PBS) и инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
  2. Приготовьте раствор первичного антитела в 1% нормальной сыворотке в 1× PBS в концентрации, рекомендованной производителем.
  3. Замените блокирующий раствор раствором первичного антитела. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Промойте клетки дважды 1% нормальной сывороткой в 1× PBS по 10 минут на каждую отмывку при комнатной температуре.
  5. Разведите вторичное антитело в 1% нормальной сыворотке в 1× PBS, следуя рекомендациям производителя.
  6. Инкубируйте клетки в растворе вторичного антитела в течение 30 минут при комнатной температуре.
  7. Промойте клетки дважды 1% нормальной сывороткой в 1× PBS по 10 минут на каждую отмывку при комнатной температуре.
  8. Замените раствор для отмывки на 1× PBS.
  9. Поместите образцы под микроскоп и выполните съемку.

Д. Анализ методом SDS-PAGE

Ковалентная связь между белком HaloTag® и лигандом выдерживает денатурацию, что позволяет количественно определять меченый гибридный белок методом SDS-PAGE с использованием флуоресцентного сканера.

  1. Приготовьте 4× SDS буфер (0,24 M Tris, 2% SDS, 50,4% глицерин, 0,4 M DTT, 3 mM бромфеноловый синий). Доведите его pH до 6,8 с помощью HCl. Для приготовления 1× буфера разведите 4× буфер в соотношении 1:4 фильтрованной водой.
  2. Пометьте клетки, следуя шагам 1–3 раздела A (Быстрое мечение) или шагам 1–6 раздела Б (Pulse-chase мечение).
  3. Замените среду, содержащую лиганд, на 1× PBS (pH 7,5), чтобы избежать появления яркой полосы от полной культуральной среды.
  4. Лизируйте клетки, заменив 1× PBS на примерно 100–150 мкл 1× SDS буфера на см² площади клеток.
  5. Соберите клеточный лизат и инкубируйте его в течение 5 минут при 95°C.
  6. Проведите SDS-PAGE, загружая примерно 10 мкл (5–10 мкг общего белка) каждого образца в лунку геля, либо храните образцы при −20°C для последующего использования.
  7. Проанализируйте гель с помощью флуоресцентного сканера.
    Примечание: фронт красителя может содержать флуоресцентный материал (несвязанный лиганд и/или красители из буфера образца), что может затруднять детекцию. Чтобы устранить эти источники неспецифической флуоресценции, просто дайте фронту красителя выйти за пределы геля или отрежьте его от нижней части геля перед сканированием.

Е. Анализ методом проточной цитометрии

  1. Пометьте клетки, экспрессирующие гибридный белок HaloTag®, с использованием лиганда HTag, следуя шагам 1–3 раздела A или шагам 1–6 раздела Б.
  2. Подготовьте контроли:
    • (а) Пометьте клетки, не экспрессирующие белок HaloTag®, лигандом HTag для оценки фона от лиганда.
    • (б) Подготовьте немеченые клетки, экспрессирующие белок HaloTag®, для оценки фона, обусловленного эндогенной флуоресценцией клеток или морфологическими изменениями вследствие экспрессии.
  3. Если адгезионные клетки с HaloTag® экспрессируют гибридный белок на поверхности клетки, промойте их дважды равным объёмом 1× PBS, затем инкубируйте в 1× PBS с 3 mM EDTA или другим неферментативным раствором при 37°C в течение 5–15 минут для мягкого отделения клеток. Если адгезионные клетки экспрессируют гибридный белок HaloTag® внутриклеточно, суспендируйте их с использованием подходящего раствора, содержащего трипсин.
  4. Соберите и ресуспендируйте клетки в культуральной среде при 37°C до концентрации 0,5–1 × 10⁶ клеток/мл.
  5. Произведите анализ методом проточной цитометрии.

Устранение проблем

Хотя приведённые выше рекомендации должны обеспечивать хорошее соотношение сигнал/шум, конкретное мечение зависит от уровня экспрессии гибридного белка HaloTag®, типа клеток, их состояния, качества фиксации, отмывки несвязанного лиганда и т.д. Ниже приведены возможные проблемы мечения и способы их устранения:

Слабый или отсутствующий флуоресцентный сигнал в меченых клетках

  • Для предотвращения протеолиза при лизисе клеток в PBS добавляйте ингибиторы протеаз или проводите лизис при 4°C.
  • Увеличьте время культивирования клеток перед мечением, чтобы обеспечить достаточный уровень экспрессии белка и плотность клеток.
  • Обеспечьте оптимальные условия для клеток. Производите мечение и визуализацию только в полной (т.е. содержащей сыворотку) культуральной среде при 37°C в соответствующих условиях CO₂.
  • Оптимизируйте протоколы мечения, увеличивая время инкубации.
  • Храните лиганды HTag в сухом виде при −20°C, защищая от света. Стоковые растворы лиганда храните в виде одноразовых аликвот, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.
  • Используйте свежеприготовленный раствор лиганда HTag и добавляйте его к клеткам немедленно после приготовления.
  • Убедитесь, что используется правильный набор фильтров для визуализации.
  • Отрегулируйте настройки прибора для регистрации флуоресценции (например, мощность лазера, усиление PMT и апертуру конфокального микроскопа).

Высокий фоновый флуоресцентный сигнал в живых клетках

  • Снизьте концентрацию лиганда HTag.
  • Увеличьте длительность отмывок и проводите их в полной среде.
  • Проводите визуализацию клеток в полной среде без фенолового красного.
  • Строго соблюдайте рекомендуемые температуры мечения.
  • Отрегулируйте настройки прибора (например, уменьшите мощность лазера, усиление PMT или апертуру).

Высокий фоновый флуоресцентный сигнал в фиксированных клетках

  • Увеличьте время отмывок и/или проводите отмывки при более высокой концентрации Triton X-100 или с использованием альтернативного детергента.
  • Снизьте концентрацию красителя.

Клетки отрываются от поверхности

  • Обращайтесь с клетками аккуратно, чтобы сохранить их прикрепление к поверхности. Попробуйте сократить количество замен среды.
  • Проводите все этапы мечения, отмывки и визуализации в полной культуральной среде, по возможности удерживая клетки при 37°C в CO₂-инкубаторе.
  • Увеличьте плотность посева или продлите время культивирования, чтобы клетки лучше пролиферировали и прикреплялись.
  • Используйте адгезивные покрытия, такие поли-L-лизин, фибронектин или коллаген.

Гибель клеток или цитотоксичность

  • Оптимизируйте протокол трансфекции или используйте менее токсичный трансфекционный реагент.
  • Убедитесь, что ДНК не содержит эндотоксинов.

HaloTag® является зарегистрированной торговой маркой Promega Corporation.

Похожие товары

AF 488 HTag лиганд

Зелёный флуоресцентный субстрат для генно-инженерной бактериальной галоалкандегалогеназы, используемый для избирательного мечения гибридных белков HaloTag®.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
5559-150nmol 150 nmol
$479.00
 12 д
Оптовый заказ
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.