Наборы для флуоресцентного мечения антител

Наборы позволяют быстро ввести флуорофоры (флуоресцентные красители) в состав антитела (2-3 метки на 1 молекулу белка). В набор входят компоненты для проведения 10 реакций x 100 мкг антитела. Принцип действия основан на использовании сукцинимидного эфира красителя (берется в избытке), который в слабощелочной среде реагирует со свободными аминогруппами антитела (N-концевой аминогруппой, аминогруппой на лизине). Последующая очистка антитела от непрореагировавшего реагента производится гель-фильтрацией на микроколонках (входят в набор). Для мечения используются полностью растворимые в воде красители, поэтому наборы отлично подходят для мечения белков, в том числе антител.

Состав набора

Компонент набора Количество
1321-10rxn
10 реакций
3321-10rxn
10 реакций
7321-10rxn
10 реакций
5321-10rxn
10 реакций
6321-10rxn
10 реакций
N1320, Sulfo-Cyanine3 активированный эфир, 1 rxn 10
N3320, Sulfo-Cyanine5 активированный эфир, 1 rxn 10
N7320, Sulfo-Cyanine5.5 активированный эфир, 1 rxn 10
N5320, Sulfo-Cyanine7 активированный эфир, 1 rxn 10
N6320, sulfo-Cyanine7.5 активированный эфир, 1 rxn 10
Спин-колонка для обессоливания, PBS 10 10 10 10 10
Пробирка приемная для обессоливания, 1.5 мл 10 10 10 10 10
Пробирка приемная без крышки, 2 мл 10 10 10 10 10
Таблетка PBS, на 100 мл буфера 1 1 1 1 1
15050, DMSO, labeling grade, 1 mL 1 1 1 1 1
1584-05mL, Sodium azide solution, 3%, 0.5 mL 1 1 1 1 1
1689-15mL, Sodium bicarbonate, 126 mg 1 1 1 1 1

Хранить при температуре от +3 °C до +20 °C. Не замораживать!

Срок хранения 12 месяцев.

Протокол

1. Подготовка антитела.

Препарат антитела не должен содержать примеси свободных аминокислот или других белков, например BSA, а также компонентов буферных растворов с pH 2-7,5 или 9-12. Если антитело находится в буферном растворе с pH 8- 8,5 (на основе бикарбоната натрия или TrisHCl) и гарантированно не содержит других примесей, его можно использовать в реакции без дополнительной очистки. Если вы не уверены, что препарат антитела не содержит примесей, то обязательно проведите процедуру очистки. Для очистки антитела (при необходимости) рекомендуется использовать один из следующих методов: диализ, гель-фильтрация или ультрафильтрация на колонках, с использованием 0.1 М раствора гидрокарбоната натрия (навеска гидрокарбоната натрия есть в наборе).

Оптимальные условия для проведения мечения антитела: концентрация антитела 1 мг/мл в растворе 0.1 М гидрокарбоната натрия без посторонних примесей. Присутствие консервирующего агента азида натрия в растворе антитела (до концентрации 0.04%) не оказывает влияния на реакцию.

Если концентрация антитела ниже 1 мг/мл, то ее необходимо довести до 1 мг/мл с помощью концентрирования (ультрафильтрацией) и последующего разбавления. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После каждого концентрирования антитело разбавляется 0.1 М гидрокарбонатом натрия.

Если концентрация антитела выше 1 мг/мл, перед разбавлением рекомендуется провести его однократную промывку на колонке для ультрафильтрации с помощью 0.1 М гидрокарбоната натрия. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После промывки антитело разбавляется 0.1 М гидрокарбонатом натрия.

Концентрацию антитела рекомендуется контролировать спектрофотометрически (для этих целей лучше всего подходит бескюветный спектрофотометр).

Стоит отметить, что концентрация антитела в реакционной смеси влияет на степень мечения. Например, при постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме менее 100 мкл будет получено модифицированное антитело со степенью мечения до 4-5 молекул красителя на антитело. При постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме, большем 100 мкл, будет получено модифицированное антитело со степенью мечения 0.3-1 молекул красителя на антитело.

2. Постановка реакции.

2.1. В пробирку с лиофилизованным флуорофором (флуоресцентным красителем) добавьте раствор антитела в 0.1 М гидрокарбонате натрия (рекомендуемые количества - 100 мкг* антитела в 100 мкл**), перемешайте на вортексе до полного растворения реагента и инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.

* если необходимо провести реакцию с меньшим количество антитела, необходимо развести лиофилизованный реагент в 10 мкл безводного DMSO и взять для реакции по 1 мкл раствора на каждые 10 мкг антитела. Раствор реагента в DMSO не подлежит хранению.

3. Очистка антитела от избытка реагента.

3.1. Предварительно растворите таблетку буфера PBS в 100 мл воды.

3.2. Подготовьте колонку. Убедитесь, что колонка имеет комнатную температуру. Сорбент ресуспендируйте на вортексе. Снимите с колонки колпачки, поместите ее в пробирку для сбора жидкости и центрифугируйте получившуюся конструкцию 2 мин при 1000 g (необходимо строго соблюдать установленную скорость; для стандартного ротора радиусом 6 см, 1000 g соответствует 3800 об/мин; при центрифугировании необходимо соблюдать ориентацию колонки в роторе: выступ на верхней части колонки должен быть направлен от центра ротора). После центрифугирования удалите фильтрат.

3.3. Нанесите на колонку 400 мкл буфера PBS, центрифугируйте 2 мин при 1000 g. После центрифугирования удалите фильтрат. Перенесите колонку в 1,5 мл пробирку для сбора антитела, входящую в набор.

3.4. Нанесите в центр колонки 100 мкл** реакционной смеси, инкубируйте 1 мин, центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 g. В пробирке соберется очищенное антитело***.

**Для очистки на колонку можно наносить от 50 до 100 мкл. Если реакция проводилась в меньшем объеме, рекомендуется после реакции довести объем препарата минимум до 50 мкл путем добавления буфера PBS.

***После центрифугирования к препарату антитела можно добавить раствор азида натрия (имеется в наборе) в объеме 1% от объема препарата. При необходимости препарат антитела можно разделить на аликвоты по мере центрифугирования. В этом случае аликвоту, с которой ведется работа, следует хранить при +4°С, остальные аликвоты - при -20°С. При +4°С допустимо хранить только те растворы, в которые добавлен азид натрия.

4. Контроль количества флуорофоров, прореагировавших с антителом.

Для того чтобы вычислить степень мечения (число молекул флуорофора, введенных на 1 молекулу антитела), необходимо измерить оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм (AAB) и длине волны максимума поглощения красителя (Adye). Типичный вид спектра поглощения показан на рисунке. В зависимости от красителя длина волны максимума его поглощения может меняться.

Спектр поглощения меченого антитела

В спектре поглощения меченого антитела присутствует пик красителя (длинноволновый), и пик поглощения антитела (~280 нм). Число молекул флуорофора на 1 молекулу антитела рассчитывается по формуле:

Расчет числа молекул флуорофора на молекулу антитела

где Dye/AB - искомое число молекул красителя на молекулу антитела, Adye - оптическая плотность образца на длине волны максимума поглощения красителя, AAB - оптическая плотность образца на длине волны 280 нм, εAB - мольный коэффициент экстинкции антитела на длине волны 280 нм (для IgG - 210000), εDye - мольный коэффициент экстинкции красителя на длине волны максимума поглощния (берется из таблицы ниже), CF280 - фактор коррекции для красителя на длине волны 280 нм (берется из таблицы ниже).

Красительλmax, нмεCF280
sulfo-Cyanine3548162 0000.06
sulfo-Cyanine5646271 0000.04
sulfo-Cyanine5.5673195 0000.11
sulfo-Cyanine7750240 6000.04
sulfo-Cyanine7.5778222,0000.09

Пример расчета

В ходе реакции мечения антитела IgG красителем sulfo-Cyanine5 после очистки был получен препарат, имеющий спектр поглощения на рисунке выше. Определить степень мечения антитела.

По спектру поглощения находим Adye = 0.184 на длине волны максимума поглощения красителя (646 нм, см. таблицу), AAB = 0.066 (на длине волны 280 нм). εAB = 210000 для IgG, из таблицы берем εDye = 271000 и CF280 = 0.04.

Dye/AB - искомое число молекул красителя на молекулу антитела - составляет 2.43 молекулы флуорофора на антитело.

Интерпретация результатов и хранение антител

Оптимальная степень мечения для получения хорошего флуоресцентного сигнала составляет в большинстве случаев 2-3 молекулы красителя на молекулу антитела. Дальнейший рост степени мечения не приводит к существенному усилению флуоресцентного сигнала, поскольку наблюдается концентрационное тушение флуоресценции. Если степень мечения недостаточна, необходимо уменьшить количество антитела, вводимого в реакцию. Низкая степень мечения может быть связана с использованием набора с истекшим сроком годности.

Антитела после мечения желательно протестировать на предмет их связывания с субстратом. Хранить меченые антитела можно при -20°С. Аликвоту, с которой ведется работа, необходимо хранить при +4°С во избежание многократного замораживания-оттаивания. Стабильность конъюгатов определяется стабильностью самого антитела, а не флуорофора. Не следует хранить меченые антитела на прямом солнечном свету, однако они вполне совместимы с комнатным освещением.

Наборы

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine3

Готовый набор для мечения антител (и других белков подобного размера) красителем sulfo-Cyanine3 в форме активированного эфира. Набор содержит все необходимые реагенты и расходные материалы.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1321-10rxn 10 rxn $390.00 в наличии

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine5

Набор для мечения антител красителем sulfo-Cyanine5, эквивалентным Cy5.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
3321-10rxn 10 rxn $390.00 в наличии

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine5.5

Набор для мечения антител красителем sulfo-Cyanine5.5, эквивалентным Cy5.5.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
7321-10rxn 10 rxn $390.00 в наличии

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine7

Набор для мечения антител красителем sulfo-Cyanine7, эквивалентным Cy7.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
5321-10rxn 10 rxn $390.00 в наличии

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine7.5

Набор для мечения антител красителем sulfo-Cyanine7.5, эквивалентным Cy7.5.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
6321-10rxn 10 rxn $390.00 в наличии

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.