Инструкция к наборам для флуоресцентного мечения антител

Состав набора

Протокол

1. Подготовка антитела

Препарат антитела не должен содержать примеси свободных аминокислот или других белков, например, БСА, а также компонентов буферных растворов с pH 2–7,5 или 9–12. Если антитело находится в буферном растворе с pH 8–8,5 (на основе бикарбоната натрия или Tris-HCl) и гарантированно не содержит других примесей, его можно использовать в реакции без дополнительной очистки. Если вы не уверены, что препарат антитела не содержит примесей, то обязательно проведите процедуру очистки. Для очистки антитела (при необходимости) рекомендуется использовать один из следующих методов: диализ, гель-фильтрация или ультрафильтрация на колонках, с использованием 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия*.

Оптимальные условия для проведения мечения антитела: концентрация антитела 1 мг/мл в растворе 0,1 М гидрокарбоната натрия без посторонних примесей. Присутствие консервирующего агента азида натрия в растворе антитела (до концентрации 0,04%) не оказывает влияния на реакцию.

Если концентрация антитела ниже 1 мг/мл, то ее необходимо довести до 1 мг/мл с помощью концентрирования (ультрафильтрацией) и последующего разбавления. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После каждого концентрирования антитело разбавляется 0,1 М гидрокарбонатом натрия.

Если концентрация антитела выше 1 мг/мл, перед разбавлением рекомендуется провести его однократную промывку на колонке для ультрафильтрации с помощью 0,1 М гидрокарбоната натрия. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После промывки антитело разбавляется 0,1 М гидрокарбонатом натрия.

Концентрацию антитела рекомендуется контролировать спектрофотометрически (для этих целей лучше всего подходит бескюветный спектрофотометр).

Стоит отметить, что концентрация антитела в реакционной смеси влияет на степень мечения. Например, при постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме менее 100 мкл будет получено модифицированное антитело со степенью мечения до 4–5 молекул красителя на антитело. При постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме, большем 100 мкл, будет получено модифицированное антитело со степенью мечения 0,3–1 молекул красителя на антитело.

* Для приготовления 0,1 М гидрокарбоната натрия необходимо к содержимому пробирки с сухим гидрокарбонатом натрия, входящей в состав набора, добавить 15 мл деионизированной воды.

2. Постановка реакции

2.1. В пробирку с лиофилизованным флуорофором (флуоресцентным красителем) добавьте раствор антитела в 0,1 М гидрокарбонате натрия (рекомендуемые количества — 100 мкг** антитела в 100 мкл), перемешайте на вортексе до полного растворения реагента и инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.

** Если необходимо провести реакцию с меньшим количество антитела, необходимо развести лиофилизованный реагент в 10 мкл безводного ДМСО и взять для реакции по 1 мкл раствора на каждые 10 мкг антитела. Раствор реагента в ДМСО не подлежит хранению.

3. Очистка антитела от избытка реагента

3.1. Предварительно растворите таблетку буфера PBS в 100 мл воды.

3.2. Подготовьте колонку. Убедитесь, что колонка имеет комнатную температуру. Сорбент ресуспендируйте на вортексе. Снимите с колонки колпачки, поместите ее в пробирку для сбора жидкости и центрифугируйте получившуюся конструкцию 2 мин при 1000 g (необходимо строго соблюдать установленную скорость; для стандартного ротора радиусом 6 см, 1000 g соответствует 3800 об/мин; при центрифугировании необходимо соблюдать ориентацию колонки в роторе: выступ на верхней части колонки должен быть направлен от центра ротора). После центрифугирования удалите фильтрат.

3.3. Нанесите на колонку 400 мкл буфера PBS, центрифугируйте 2 мин при 1000 g. После центрифугирования удалите фильтрат. Перенесите колонку в 1,5 мл пробирку для сбора антитела, входящую в набор.

3.4. Нанесите в центр колонки 100 мкл*** реакционной смеси, инкубируйте 1 мин, центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 g. В пробирке соберется очищенное антитело****.

*** Для очистки на колонку можно наносить от 50 до 100 мкл. Если реакция проводилась в меньшем объеме, рекомендуется после реакции довести объем препарата минимум до 50 мкл путем добавления буфера PBS.

**** После центрифугирования к препарату антитела можно добавить раствор азида натрия (имеется в наборе) в объеме 1% от объема препарата. При необходимости препарат антитела можно разделить на аликвоты по мере центрифугирования. В этом случае аликвоту, с которой ведется работа, следует хранить при +4°С, остальные аликвоты — при −20°С. При +4°С допустимо хранить только те растворы, в которые добавлен азид натрия.

4. Контроль количества флуорофоров, прореагировавших с антителом

Для того чтобы вычислить степень мечения (число молекул флуорофора, введенных на 1 молекулу антитела), необходимо измерить оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм (A_AB) и длине волны максимума поглощения красителя (A_Dye). Типичный вид спектра поглощения показан на рисунке. В зависимости от красителя длина волны максимума его поглощения может меняться.

В спектре поглощения меченого антитела присутствует пик красителя (длинноволновый), и пик поглощения антитела (~280 нм). Число молекул флуорофора на 1 молекулу антитела рассчитывается по формуле:

где Dye/AB — искомое число молекул красителя на молекулу антитела, A_Dye — оптическая плотность образца на длине волны максимума поглощения красителя, A_AB — оптическая плотность образца на длине волны 280 нм, ε_AB — мольный коэффициент экстинкции антитела на длине волны 280 нм (для IgG — 210000), ε_Dye — мольный коэффициент экстинкции красителя на длине волны максимума поглощения (берется из таблицы ниже), CF₂₈₀ — фактор коррекции для красителя на длине волны 280 нм (берется из таблицы ниже).

Пример расчета

В ходе реакции мечения IgG красителем sulfo-Cyanine5 после очистки был получен препарат, имеющий спектр поглощения на рисунке выше. Определить степень мечения антитела.

По спектру поглощения находим A_Dye = 0,184 на длине волны максимума поглощения красителя (646 нм, см. таблицу), A_AB = 0,066 (на длине волны 280 нм). ε_AB = 210000 для IgG, из таблицы берем ε_Dye = 271000 и CF₂₈₀ = 0,04.

Dye/AB — искомое число молекул красителя на молекулу антитела — составляет 2,43 молекулы флуорофора на антитело.