Флуоресцентное окрашивание по Нисслю срезов мозга

Окрашивание по Нисслю — широко используемый гистологический метод визуализации морфологии нервной ткани. Метод основан на взаимодействии основных красителей с нуклеиновыми кислотами клеток. Из-за интенсивного синтеза белка, перикарион нейронов имеет высокое содержание рибосомальной РНК в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (т. н. «вещество Ниссля»), и в следствие этого, окрашивание нейронов основными красителями в цитоплазме более выражено, чем в ядрах. На этом основании окрашенные по Нисслю нейроны можно отличить от глиальных клеток, а данный метод считается специфичным для обнаружения нейронов.

Флуоресцентные красители для окрашивания по Нисслю (Fluorescent Nissl Stains) представляют собой непроникающие в живые клетки красители, которые не флуоресцируют в отсутствие нуклеиновых кислот, но многократно усиливают свою флуоресценцию при связывании с РНК и ДНК. Мы предлагаем высококонцентрированные (1000×) флуоресцентные красители для метода Ниссля, обладающие различными спектральными свойствами.

Обращение и утилизация

Перед открытием каждую пробирку следует нагреть до комнатной температуры, а затем кратковременно центрифугировать в микроцентрифуге, чтобы раствор стек на дно пробирки. Если в растворе присутствуют частицы красителя, их необходимо растворить повторно, кратковременно обработав ультразвуком или энергично встряхнув пробирку после нагревания.

В настоящее время нет данных о мутагенности или токсичности данных красителей. Поскольку они связываются с нуклеиновыми кислотами, их следует рассматривать как потенциальные мутагены и обращаться с ними с соответствующей осторожностью. Работа со стоковыми растворами в ДМСО требует особого внимания, так как ДМСО усиливает всасывание органических молекул в ткани организма. Как и все красители нуклеиновых кислот, растворы красителей для окрашивания по Нисслю следует утилизировать в соответствии с местными рекомендациями.

Прежде чем начать

  • Если окрашивание методом Ниссля совмещается с иммуногистохимией, сначала необходимо провести инкубации антител, и после этого окрашивание по Нисслю.
  • Блокирующие растворы, содержащие лошадиную сыворотку, бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко, могут гасить сигнал флуоресцентного красителя для окрашивания по Нисслю. Используйте 0,5% рыбий желатин в качестве альтернативы этим реагентам.

Окрашивание замороженных срезов мозга

  1. Соберите замороженные срезы мозга на предметном стекле, покрытом поли-L-лизином. Дайте им подсохнуть.
    Важно! Поскольку при окрашивании на стеклах диффузия красителя происходит только с одной стороны препарата, мы не рекомендуем использовать для этой цели срезы толще 25 мкм.
  2. Фиксируйте срезы холодным нейтральным 4% параформальдегидом в течение 15 мин.
  3. Промойте срезы дважды по 10 мин в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4).
  4. Пермеабилизируйте срезы инкубацией в 0,1% TBS (PBS с 0,1% Triton® X-100) в течение 10 мин при комнатной температуре. Данный шаг важен для достижения оптимального окрашивания.
  5. Промойте срезы дважды по 5 мин в PBS.
  6. Приготовьте окрашивающий раствор. Для этого добавьте концентрат красителя в пробирку с PBS в соотношении 1:1000 и тщательно перемешайте растворы. Оптимальное разведение красителя определяется эмпирическим путем.
  7. Нанесите примерно 200 мкл окрашивающего раствора на предметное стекло так, чтобы срез был полностью покрыт. Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
  8. Удалите краситель и промойте срезы в 0,1% TBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  9. Промойте срезы дважды по 5 мин в PBS.
  10. Для достижения наилучших результатов промойте срезы в PBS дополнительно в течение 2 ч при комнатной температуре или оставьте их в PBS на ночь при 4°C.
  11. При необходимости контрастируйте срезы и промойте их в PBS.

Окрашивание свободно плавающих срезов мозга

  1. Изготовьте срезы фиксированного мозга и соберите их в лунки планшета для культивирования клеток.
  2. Промойте срезы дважды по 10 мин в PBS.
  3. Пермеабилизируйте срезы инкубацией в 0,1% TBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Данный шаг важен для достижения хорошего прокрашивания.
  4. Приготовьте окрашивающий раствор. Для этого добавьте концентрат красителя в пробирку с PBS в соотношении 1:1000 и тщательно перемешайте растворы. Оптимальное разведение красителя определяется эмпирическим путем.
  5. Добавьте 500 мкл окрашивающего раствора в каждую лунку со срезами и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Удалите краситель и промойте срезы в 0,1% TBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Промойте срезы дважды по 5 мин в PBS.
  8. Для достижения наилучших результатов промойте срезы в PBS дополнительно в течение 2 ч при комнатной температуре или оставьте их в PBS на ночь при 4°C.
  9. При необходимости контрастируйте срезы и промойте их в PBS.
  10. Соберите срезы на покрытые поли-L-лизином или желатином предметные стекла.

Заключение под покровные стекла

  1. Нанесите на предметное стекло подходящую заключающую среду и накройте срезы покровным стеклом. Мы рекомендуем использовать для заключения среду LumiMount и наш подробный протокол для монтирования покровных стекол.
  2. Окрашивание остается сохранным в течение нескольких недель или дольше, если предметное стекло хранится в темноте при температуре 4°C или −20°C. Со временем фон на препарате может усилиться, поскольку краситель постепенно вымывается в заключающую среду.

Похожие товары

Deep-Red Fluorescent Nissl Stain

Дальне-красный флуоресцентный краситель для окрашивания по Нисслю и оценки морфологии нервной ткани.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1A010 50 uL –   в наличии
2A010 500 uL $189 в наличии
Запросить образец
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!
Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.