Тирамидная амплификация сигнала (TSA)

Данный протокол тирамидной амплификации сигнала (TSA) можно использовать для обнаружения сигнала в образцах, меченных пероксидазой, как при иммуноокрашивании, так и при гибридизации in situ. Все инкубации осуществляются на шейкере.

Реактивы:

2-4% формальдегид, рН 7,4
фосфатный буфер (PBS), рН 7,4
PBT: 0,1% Твин-20; PBS, pH 7,4
1мМ азид натрия в PBT
30% H₂O₂
1 мг/мл сток флуоресцентно меченного тирамида в ДМСО для мечения

Опционально:

декстрансульфат (DS)
4-йодфенол
кислый глициновый буфер: 0,1 М глицин; pH 2,0; 0,1% Твин-20

Протокол:

Фиксируйте образец необходимым способом. В большинстве случаев фиксацию осуществляют холодным 2-4% формальдегидом (рН 7,4). Отмойте образец от фиксатора фосфатным буфером (PBS, рН 7,4) и PBT (0,1% Твин-20; PBS, pH 7,4).
Ингибируйте эндогенные пероксидазы инкубацией образца в ингибирующем растворе (1мМ азид натрия в PBT) в течение 30-60 мин при комнатной температуре.

Опционально. Вместо 1мМ азида натрия для ингибирования можно использовать 3% H₂O₂ в РВТ, либо 0,02 N HCl. Для последующей иммунохимии данный этап может быть совмещен с блокированием неспецифического связывания антител. Для этого в растворы азида или Н₂О₂ необходимо добавить блокирующую сыворотку или 1% БСА.

При низком фоне или для гибридизации in situ данный этап можно пропустить и напрямую перейти к п.4.

Тщательно отмойте образец от ингибирующего раствора тремя инкубациями в PBT по 10 мин при комнатной температуре.
Проведите все этапы иммунохимии и гибридизации in situ для мечения образцов конъюгированными с пероксидазой антителами.
Тщательно отмойте образец от антител тремя инкубациями в PBT по 10 мин при комнатной температуре.
Приготовьте реакционный буфер непосредственно перед использованием. Для этого 30% H₂O₂ дважды разбавьте PBT, 1:100 каждый раз, до концентрации 0,003% (1:10000).

Опционально. Для повышения чувствительности метода в реакционную смесь можно добавить следующие компоненты (отдельно или в комбинации):

2% декстрансульфат (DS), используют для увеличения вязкости реакционной смеси.
500 мкг/мл 4-йодфенола, используют для усиления пероксидазной реакции. Удобнее использовать как разведение 1:200 стокового раствора (100 мг/мл в этаноле).

Добавьте в реакционный буфер от 1 до 10 мкг/мл меченного тирамида (оптимальную концентрацию необходимо определять опытным путем). Перемешайте встряхиванием.
Инкубируйте образец с реакционным буфером в темноте при комнатной температуре в течение 5–30 мин (точное время определяется опытным путем, 15 мин можно взять за отправную точку).
Остановите реакцию инкубацией образца в ингибирующем растворе (1мМ азид натрия; PBT) 10 мин при комнатной температуре в темноте.
Отмойте образец с помощью PBS три раза по 10 мин.
Для повторного цикла мечения антителами и TSA, обработайте образец кислым глициновым буфером (0,1% Твин-20; 0,1 М глицин, pH 2,0) в течение 10 мин при комнатной температуре. Данная процедура открепляет связанные с антигеном антитела, не затрагивая при этом связанный ковалентно с белками тирамид.
Заключите образец под покровное стекло при помощи монтировочной среды.

Проблемы и их устранение

ПРОБЛЕМА	РЕКОМЕНДУЕМОЕ ДЕЙСТВИЕ
Слабый сигнал	Оптимизируйте концентрацию пробы / антител Оптимизируйте концентрацию конъюгата перексидазы хрена Добавьте этап пермеабилизации для облегчения приникновения реагентов Увеличьте время инкубации с раствором тирамида Добавьте этап демаскирования антигена
Избыточный сигнал	Оптимизируйте концентрацию пробы / антител Уменьшите концентрацию конъюгата перексидазы хрена Уменьшите концентрацию тирамида в красящем растворе Уменьшите время инкубации в красящем растворе тирамида
Низкое разрешение или размытый сигнал	Уменьшите время инкубации в красящем растворе тирамида Оптимизируйте концентрацию ингибирующего раствора
Высокий фон	Уменьшите концентрацию пробы / антител Используйте меньшую концентрацию вторичных антител Уменьшите концентрацию конъюгата перексидазы хрена Высокий уровень эндогенного биотина (при использовании конъюгатов стрептавидина) Проверьте специфичность антител Уменьшите время инкубации в красящем растворе тирамида Удлините время ингибирования эндогенных пероксидаз Увеличьте число и/или длительность отмывок Некачественный или загрязненный блокирующий реагент Профильтруйте буферы
Яркие точки на фоне	Отцентрифугируйте пробирку с антителами перед использованием

Похожие товары

AF 488 тирамид

Тирамидное производное зеленого флуоресцентного красителя AF 488, широко используемое в IHC, ICC и FISH для тирамидной амплификации сигнала (TSA).

Показать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки	Купить товар
3805-1mg	1 mg	$150	в наличии

Оптовый заказ