Мечение биомолекул активированными эфирами

Активированные эфиры, такие как NHS- (N-гидроксисукцинимидные), а также другие (sulfo-NHS, STP-), являются реакционноспособными производными, способными модифицировать аминогруппы биомолекул. Наиболее часто используются NHS-эфиры.

С помощью активированных эфиров часто вводят репортерные группы, такие как флуоресецентные красители. Алкины и азидогруппы могут быть также введены в состав биомолекул с помощью соответствующих активированных эфиров для того, чтобы подготовить биомолекулы к модификации через Click Chemistry.

Поскольку почти все белки и пептиды содержат аминогруппы, их модификация особенно часто проводится этим посредством активированных эфиров. Другие биомолекулы, которые могут быть помечены - амино-ДНК, олигонуклеотиды с аминолинком, и амино-содержащие сахара.

Реакция активированных эфиров с аминами проявляет существенную зависимость от pH. При низких значениях pH происходит протонирование аминогрупп, в результате чего снижается эффективность реакции. При высоких значениях существенным становится процесс гидролиза активированного эфира. Оптимальным значением pH для модификации является 8.3-8.5.

Обычно в качестве растворителя для модификации биополимеров используют воду. Поскольку многие активированные эфиры имеют низкую растворимость в воде, в качестве сорастворителя применяют диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФ). Раствор активированного эфира в органическом растворителе прибавляют к раствору биополимера в буфере, обеспечивающем оптимальное значение pH. Диметилформамид может портиться при хранении, при этом в нем накапливается диметиламин, способный реагировать с активироваными эфирами. Поэтому ДМФ для мечения должен бытьхорошего качества (при этом он не имеет запаха диметиламина).

Мы рекомендуем следующий общий протокол для мечения активированными эфирами.

  1. Рассчитайте количество активированного эфира:

    МассаАктивированногоЭфира [мг] = 8 × МассаАмина [мг] × МолекулярнаяМассаАктивированногоЭфира [Да] / МолекулярнаяМассаАмина [Да].

    Число 8 - избыток активированного эфира. Это экспериментальное значение для достижения моно-мечения, обычное для водорастворимых белков и пептидов. Во многих случаях, однако, это значение необходимо оптимизировать, так как оно зависит от структуры и растворимости белка и активированного эфира. Молекулярные массы активированных эфиров Lumiprobe могут быть найдены на страницах соответствующих продуктов.

    Например, чтобы пометить 3 мг BSA (молекулярная масса 69300 Да) активированным эфирам Cy5 NHS (молекулярная масса 592 Да), и получить в среднем мономеченный продукт, необходимо взять 8 × 3 мг × 592 Да / 69300 Да = 0.21 мг активированного эфира Cy5 NHS.

  2. Определите объем реакционной смеси. Реакцию можно проводить на любой шкале от наномолей до десятков граммов. При мечении минимальных количеств используйте минимальный объем реакции (10-20 мкл). Оптимальная конентрация белка для мечения составляет 1-10 мг на мл смеси и более.

  3. Растворите активированный эфир в чистом ДМФ или ДМСО (1/10 объема реакционной смеси). Для водорастворимых активированных эфиров можно использовать воду (водный раствор необходимо использовать и нельзя хранить). Растворы в безводном ДМФ можно на протяжении 1-2 месяцев при -20ºC.

  4. Растворите амин (белок, амино-ДНК и т.д.) в буфере pH 8.3-8.5 (объем - 9/10 реакционной смеси). Можно использовать 0.1 М раствор бикарбоната натрия (NaHCO3). Альтернативные буферы - 0.1 М Трис (хотя Трис содержит аминогруппу, она является малореакционноспособной в отношении активированных эфиров), или 0.1 М фосфатный буфер с pH 8.3-8.5. Значение pH буфера наиболее важно для успеха реакции.

    При мечении значительных количеств веществ (когда количество активированного эфира составляет сотни миллиграмм) следует учитывать тенденцию к закислению смеси при гидролизе активированного эфира. Необходимо использовать более концентрированный буфер и следить за значением pH.

  5. Добавьте раствор активированного эфира к раствору амина в буфере и хорошо размешайте на вортексе. Инкубируйте на льду в течение ночи, или при комнатной температуре в течение по меньшей мере 4 часов.

  6. Очистите конъюгаты с помощью подходящего метода. Для макромолекул наиболее подходит гель-фильтрация. Можно использовать переосаждение или хроматографию. Органические примеси (такие как N-гидроксисукцинимид , активированный эфир и соответствующая кислота, образующаяся при гидролизе), как правило, хорошо отделаются от продукта. Для белков и нуклеиновых кислот можно использовать осаждение этанолом или ацетоном.

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.