Мечение активированными эфирами биомолекул, содержащих первичные аминогруппы

Активированные эфиры, такие как NHS- (N-гидроксисукцинимидные), а также другие (sulfo-NHS, STP-), являются реакционноспособными производными, способными модифицировать аминогруппы биомолекул. Наиболее часто используются NHS-эфиры.

С помощью активированных эфиров часто вводят репортерные группы, такие как флуоресецентные красители. Алкины и азидогруппы могут быть также введены в состав биомолекул с помощью соответствующих активированных эфиров для того, чтобы подготовить биомолекулы к модификации через клик-реакции.

Поскольку почти все белки и пептиды содержат аминогруппы, их модификация особенно часто проводится посредством активированных эфиров. Другими примерами являются модификации аминоолигонуклеотидов, аминомодифицированная ДНК и аминосодержащие сахара.

Реакция активированных эфиров с аминами проявляет существенную зависимость от pH. При низких значениях pH происходит протонирование аминогрупп, в результате чего снижается эффективность реакции. При рН выше оптимального гидролиз активированного эфира происходит слишком быстро, и выход модифицированной молекулы снижается. Оптимальным значением pH для модификации является 8.3-8.5.

Обычно в качестве растворителя для модификации биополимеров используют воду. Поскольку многие активированные эфиры имеют низкую растворимость в воде, в качестве сорастворителя применяют диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФ). Раствор активированного эфира в органическом растворителе добавляют к раствору биополимера в буфере, обеспечивающем оптимальное значение pH.

Важно! Диметилформамид при хранении может разлагаться до диметиламина, который имеет рыбный запах и способен реагировать с активированными эфирами. Поэтому для мечения важно использовать высококачественный ДМФ, не содержащий диметиламина и не имеющий рыбного запаха.

Мы рекомендуем следующий общий протокол для мечения активированными эфирами от Lumiprobe:

1. Рассчитайте необходимое количество активированного эфира, используя приведенную ниже формулу или наш калькулятор мечения белков:
   МассаАктивированногоЭфира [мг] = 8 × МассаАмина [мг] × МолекулярнаяМассаАктивированногоЭфира [Да] / МолекулярнаяМассаАмина [Да].
   Число 8 — избыток активированного эфира. Это экспериментальное значение для достижения моно-мечения, обычное для водорастворимых белков и пептидов. Во многих случаях, однако, это значение необходимо оптимизировать, так как оно зависит от структуры и растворимости белка и активированного эфира. Молекулярные массы активированных эфиров Lumiprobe могут быть найдены на страницах соответствующих продуктов.
   Например, чтобы пометить 3 мг BSA (молекулярная масса 66500 Да) активированным эфиром Cy5 NHS (молекулярная масса 616 Да), и получить в среднем мономеченный продукт, необходимо взять 8 × 3 мг × 616 Да / 66500 Да = 0.22 мг активированного эфира Cy5 NHS.
2. Определите объем реакционной смеси. Реакцию можно проводить на любой шкале от наномолей до десятков граммов. При мечении минимальных количеств используйте минимальный объем реакции (10-20 мкл). Оптимальная концентрация белка для мечения составляет 1-10 мг на мл смеси и более.
3. Растворите активированный эфир в 1/10 реакционного объема воды, ДМФ или ДМСО. Вода или ДМФ, не содержащий диметиламина, являются предпочтительными растворителями. Активированные эфиры, растворенные в ДМФ, могут храниться в растворе в течение 1-2 месяцев при −20°C. Водные растворы NHS-эфиров следует использовать сразу после приготовления.
4. Растворите амин (белок, амино-ДНК и т.д.) в буфере с pH 8.3-8.5 объемом 9/10 реакционной смеси.
   Обычно используют 0.1 М раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃). В качестве альтернативы можно использовать 0.1 М фосфатный буфер. Значение pH буфера наиболее важно для качества реакции. Избегайте использования буферов, содержащих амины. Можно использовать буферы на основе Tris, однако это не рекомендуется, поскольку Tris содержит аминогруппу (хотя ее сродство к активированным сложным эфирам незначительно).
   При мечении значительных количеств веществ (когда количество активированного эфира составляет сотни миллиграмм) следует учитывать тенденцию к закислению смеси при гидролизе активированного эфира. Необходимо использовать более концентрированный буфер и следить за значением pH.
5. Добавьте раствор активированного эфира к раствору амина в буфере и хорошо размешайте на вортексе. Инкубируйте на льду в течение ночи, или при комнатной температуре в течение от 1 до 4 часов.
6. Очистите конъюгаты с помощью подходящего метода. Для макромолекул наиболее подходит гель-фильтрация. Можно использовать переосаждение или хроматографию. Для белков и нуклеиновых кислот можно использовать осаждение этанолом или ацетоном. Органические примеси (такие как N-гидроксисукцинимид , активированный эфир и соответствующая кислота, образующаяся при гидролизе), как правило, хорошо отделяются от продукта.