Мечение малеимидами белков и других тиолированных биомолекул

Реакция тиолов с малеимидами широко используется для биоконъюгации и мечения различных биомолекул, включая белки и пептиды. Реакция протекает по следующей схеме:

Малеимиды представляют собой электрофильные соединения, обладающие высокой селективностью по отношению к тиолам. Хотя малеимиды почти никогда не встречаются в природе, тиолы в ней очень распространены. В частности, они содержатся в белках и пептидах в виде остатков цистеина. Природная ДНК не содержит тиолов, однако, синтетические олигонуклеотиды с тиоловыми группами можно легко получить в лабораторных условиях.

Тиолы склонны к окислительной димеризации с образованием дисульфидных связей. Таким образом, остатки цистеина образуют дисульфидные мостики, которые стабилизируют третичные структуры белка. Дисульфиды, в отличие от тиолов, не способны реагировать с малеимидами, поэтому перед началом конъюгации необходимо восстановить дисульфиды и исключить кислород из реакции.

Протокол конъюгации зависит от растворимости исходных компонентов. Для соединений с низкой растворимостью в воде, например, большинства малеимидов флуоресцентных красителей, используют органические сорастворители, такие как ДМСО или ДМФА

Мы рекомендуем следующий протокол для конъюгации малеимидов красителей Lumiprobe с белками, пептидами и другими тиолированными биомолекулами.

1. Растворите белок или другую молекулу, содержащую тиол и подлежащую мечению, в пластиковом флаконе с дегазированном буфером, pH 7–7,5 (подходят PBS, Tris, HEPES, либо другие буферы, не содержащие тиолы). Буфер можно дегазировать, применяя к нему вакуум в течение нескольких минут или барботируя через инертный газ (азот, аргон или гелий). Для белков обычно используют концентрации от 1 до 10 мг/мл.
2. Добавьте во флакон избыток TCEP (трис-карбоксиэтилфосфина) для восстановления дисульфидных связей, продуйте смесь инертным газом и закройте флакон. Рекомендуется использовать 100-кратный молярный избыток TCEP. Инкубируйте смесь 20 мин при комнатной температуре.
3. Растворите малеимид красителя в ДМСО или свежем ДМФА (1–10 мг в 100 мкл).
4. Добавьте раствор малеимида красителя в раствор тиола (20-кратный избыток красителя), продуйте флакон инертным газом и плотно закройте.
5. Тщательно перемешайте содержимое флакона и оставьте его на ночь при +4°С или при комнатной температуре.
6. Очистите меченный продукт гель-фильтрацией, ВЭЖХ, ЖХБР или электрофорезом.

Для малеимидов с плохой растворимостью в воде, как и для большинства малеимидов красителей, мы рекомендуем использовать сорастворитель (ДМФА или ДМСО). Малеимиды с хорошей растворимостью в воде (например, sulfo-Cyanine-малеимиды) можно растворять непосредственно в воде. В случае выпадения осадка необходимо увеличить содержание органического сорастворителя в смеси, чтобы обеспечить лучший результат мечения.

Диализ рекомендуется в качестве средства очистки только для малеимидов с хорошей растворимостью в воде.