Конъюгация белков, модифицированных алкином или азидом, с азидами или алкинами красителей

Протокол

Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации модифицированных белков с производными красителей:

1. Определите общий объем реакции исходя из используемого количества модифицированного белка:
   ! Объем раствора белка, модифицированного алкином или азидом, должен составлять не более 1/3 общего объема реакции.

   Общий объём реакции, мкл	Количество белка
   100	от 4 до 20 нмоль
   200	от 20 до 40 нмоль
   400	от 40 до 80 нмоль
   600	от 80 до 600 нмоль

2. Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:

   Реагент	Объем, мкл	Концентрация стокового раствора
   Азид или алкин красителя	(количество белка [нмоль]) × 0.3*	10 мМ в ДМСО или воде
   Каталитический буфер для мечения белков	(общий объем реакции [мкл]) × 0.67	1.5х
   Активатор (аскорбиновая кислота)	(общий объем реакции [мкл]) × 0.02	50 мМ в воде
   Вода	(общий объем реакции [мкл] - объем раствора красителя [мкл] - объём каталитического буфера [мкл] - объём раствора активатора [мкл])	—

   * - избыток красителя может варьироваться в зависимости от количества азидных или алкиновых групп на молекуле белка. Расчёт в таблице приведен для избытка красителя 3х. Для избытка красителя 1.5–10х необходимо умножить количество белка (нмоль) на 0.15–1. Однако помните, что если используется нерастворимый в воде азид или алкин, большой его избыток может выпасть в осадок из реакционной смеси. Пользуйтесь водорастворимыми красителями, например сульфированными цианиновыми красителями sulfo-Cyanine.
3. Приготовьте стоковый раствор азида или алкина красителя (10 мМ в ДМСО или воде, для водорастворимых алкинов и азидов) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде).
   Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
4. Добавьте каталитический буфер для мечения белков к раствору модифицированного белка и размешайте на вортексе.
5. Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида или алкина красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
6. (рекомендуется) Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 с.
   Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать центрифужный концентратор. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 с включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
7. Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройте ее.
8. Размешайте раствор на вортексе.
9. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
10. Для выделения конъюгата белка с красителем используйте диализ или гель-фильтрацию.