Конъюгация белков, модифицированных алкином или азидом, с азидами или алкинами красителей

Каталитический буфер для мечения белков предназначен для проведения реакции CuAAC c белками и оптимизирован для предотвращения повреждения биомолекул активными формами кислорода. Для реакции подходят белки, содержащие алкиновую или азидную группы, а также клетки или компоненты клеточных лизатов, метаболически меченые азидогруппами.

Реакция конъюгации происходит между азидом и терминальной группой алкина и приводит к образованию пятичленного гетероцикла — 1,2,3-триазола. Поскольку обе группы (азида и алкина) практически не встречаются в природных биомолекулах, реакция является высокоспецифичной и эффективной для решения широкого спектра задач.

Scheme of copper catalyzed Click chemistry alkyne azide cycloaddition

Реакция протекает в присутствии соединений меди (I); она почти не зависит от pH. Каталитический буфер специально оптимизирован для работы с белками и содержит соль меди (II) — стабильный предшественник каталитически активных соединений меди (I), ацетат триэтиламмония pH 6.8, водорастворимый лиганд THPTA и аминогуанидин. Для восстановления меди (II) рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты. THPTA лиганд в составе буфера ускоряет реакцию и стабилизирует каталитически активные соединения меди (I). Кроме того, присутствие водорастворимого THPTA лиганда позволяет проводить реакцию мечения белков в водной среде (без добавления органических растворителей) и, за счёт стабилизации степени окисления (I) меди, минимизирует генерацию активных форм кислорода (АФК) и нежелательное повреждения ими белков путем окисления гистидина, метионина и цистеина. Входящий в состав буфера аминогуанидин препятствует связыванию реакционноспособных альдегидов — продуктов гидролиза дегидроаскорбата, с боковыми цепями аргинина, N-концевого цистеина и лизина.

Для проведения реакции понадобятся: модифицированный алкином или азидом белок в буфере без азида натрия, азидное или алкиновое производное красителя, 1.5х каталитический буфер, аскорбиновая кислота. Шаги 6–9 рекомендуется выполнять в атмосфере инертного газа — азота или аргона.

Протокол

Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации модифицированных белков с производными красителей:

  1. Определите общий объем реакции исходя из используемого количества модифицированного белка:
    ! Объем раствора белка, модифицированного алкином или азидом, должен составлять не более 1/3 общего объема реакции.
    Общий объём реакции, мкл Количество белка
    100 от 4 до 20 нмоль
    200 от 20 до 40 нмоль
    400 от 40 до 80 нмоль
    600 от 80 до 600 нмоль
  2. Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:
    Реагент Объем, мкл Концентрация стокового раствора
    Азид или алкин красителя (количество белка [нмоль]) × 0.3* 10 мМ в ДМСО или воде
    Каталитический буфер для мечения белков (общий объем реакции [мкл]) × 0.67 1.5х
    Активатор
    (аскорбиновая кислота)
    (общий объем реакции [мкл]) × 0.02 50 мМ в воде
    Вода (общий объем реакции [мкл] - объем раствора красителя [мкл] - объём каталитического буфера [мкл] - объём раствора активатора [мкл]) — 
    * - избыток красителя может варьироваться в зависимости от количества азидных или алкиновых групп на молекуле белка. Расчёт в таблице приведен для избытка красителя 3х. Для избытка красителя 1.5–10х необходимо умножить количество белка (нмоль) на 0.15–1. Однако помните, что если используется нерастворимый в воде азид или алкин, большой его избыток может выпасть в осадок из реакционной смеси. Пользуйтесь водорастворимыми красителями, например сульфированными цианиновыми красителями sulfo-Cyanine.
  3. Приготовьте стоковый раствор азида или алкина красителя (10 мМ в ДМСО или воде, для водорастворимых алкинов и азидов) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде).
    Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
  4. Добавьте каталитический буфер для мечения белков к раствору модифицированного белка и размешайте на вортексе.
  5. Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида или алкина красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
  6. (рекомендуется) Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 с.
    Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать центрифужный концентратор. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 с включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
  7. Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройте ее.
  8. Размешайте раствор на вортексе.
  9. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
  10. Для выделения конъюгата белка с красителем используйте диализ или гель-фильтрацию.

Похожие товары

1-Этинилпирен

Алкинильное производное пирена, флуоресцентного полициклического углеводорода, для клик-химии и реакции Соногаширы.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
515B0 50 mg $50 в наличии
615B0 100 mg $64 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

3-Этинилперилен

Этинилперилен - производное полициклического ароматического углеводорода, обладающего интенсивной флуоресценцией с квантовым выходом около 100%.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
555B0 50 mg $100 в наличии
655B0 100 mg $160 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 343 (Кумарин)-X-азид

AF 343 (Кумарин) - флуорофор, обладающий эмиссией в синей области спектра. Этот краситель может выступать в роли донора энергии для флуоресцеина. Данное азидное производное можно конъюгировать посредством клик-реакций. Удлиненный линкер обеспечивает пространственное разделение флуорофора и функциональной группы и улучшает растворимость реагента.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
12630 1 mg $105 в наличии
22630 5 mg $165 в наличии
42630 25 mg $285 в наличии
52630 50 mg $495 в наличии
62630 100 mg $880 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 384 (PEP, фенилэтинилпирен) азид

Флуорофор на основе полициклических ароматических углеводородов, флуоресцирующий в синей области. Хорошая альтернатива AMCA и другим кумариновым красителям.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A4530 1 mg $110 в наличии
B4530 5 mg $210 в наличии
C4530 10 mg $310 в наличии
D4530 25 mg $410 в наличии
E4530 50 mg $695 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 430 азид

Азидопроизводное красителя AF 430 для мечения алкин-содержащих биомолекул с помощью реакций клик-химии.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A0830 1 mg $125 в наличии
B0830 5 mg $325 в наличии
D0830 25 mg $950 в наличии
E0830 50 mg $1625 в наличии
F0830 100 mg $2090 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 430 алкин

Алкиновое производное красителя AF 430 с эмиссией в желто-зеленой области спектра для для медь-катализируемой клик-реакции с азидами.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A08B0 1 mg $125 в наличии
B08B0 5 mg $325 в наличии
C08B0 10 mg $480 в наличии
D08B0 25 mg $950 в наличии
E08B0 50 mg $1625 в наличии
F08B0 100 mg $2090 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 488 азид

Азид флуорофора AF 488, с эмиссией в зеленой области спектра. Реагирует с алкинами в медь-катализируемых реакциях циклоприсоединения.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
S1830 250 ug –   в наличии
11830 1 mg $125 в наличии
21830 5 mg $325 в наличии
41830 25 mg $950 в наличии
51830 50 mg $1625 в наличии
61830 100 mg $2090 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 488 алкин

Алкиновое производное красителя AF 488 для медь-катализируемой реакции циклоприсоединения к азидам. Чистый 5-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
S18B0 250 ug –   20 д
A18B0 1 mg $125 в наличии
B18B0 5 mg $325 в наличии
D18B0 25 mg $950 в наличии
E18B0 50 mg $1625 в наличии
F18B0 100 mg $2090 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 555 азид

Азидопроизводное флуоресцентного красителя AF 555 для конъюгации с помощью клик-химии.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
SK830 250 ug –   в наличии
1K830 1 mg $140 в наличии
2K830 5 mg $450 в наличии
4K830 25 mg $1460 в наличии
5K830 50 mg $1890 в наличии
6K830 100 mg $2640 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 568 азид

Азидопроизводное красителя AF 568 для флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A5820 1 mg $140 в наличии
B5820 5 mg $450 в наличии
C5820 10 mg $585 в наличии
D5820 25 mg $1460 в наличии
E5820 50 mg $1890 в наличии
F5820 100 mg $2990 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 568 алкин

Производное AF 568 для флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметре. Чистый 5-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A48B0 1 mg $140 в наличии
B48B0 5 mg $450 в наличии
C48B0 10 mg $585 в наличии
D48B0 25 mg $1460 в наличии
E48B0 50 mg $1890 в наличии
F48B0 100 mg $2990 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 594 азид

Азидное производное водорастворимого красного флуоресцентного красителя AF 594 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
S7830 250 ug –   в наличии
A7830 1 mg $140 в наличии
B7830 5 mg $450 в наличии
D7830 25 mg $1460 в наличии
E7830 50 mg $1890 в наличии
F7830 100 mg $2640 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AF 647 азид

Азидопроизводное красителя AF 647 для мечения алкин-содержащих молекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
S6830 250 ug –   в наличии
A6830 1 mg $140 в наличии
B6830 5 mg $450 в наличии
D6830 25 mg $1460 в наличии
E6830 50 mg $1890 в наличии
F6830 100 mg $2640 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

AMCA азид

Азидопроизводное флуоресцентного красителя AMCA для конъюгации с помощью клик-химии. AMCA — один из самых ярких синих флуоресцентных красителей с большим сдвигом Стокса и высокой устойчивостью к фотовыгоранию.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
3605-1mg 1 mg $60 в наличии
3605-5mg 5 mg $110 в наличии
3605-25mg 25 mg $540 в наличии
3605-50mg 50 mg $885 в наличии
3605-100mg 100 mg $1050 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 550 азид

Азидное производное водорастворимого желтого флуоресцентного красителя ATT 550 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1C930 1 mg $165 в наличии
2C930 5 mg $640 в наличии
4C930 25 mg $1640 в наличии
5C930 50 mg $2090 в наличии
6C930 100 mg $2840 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 565 азид

Азидное производное водорастворимого оранжевого флуоресцентного красителя ATT 565 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1A930 1 mg $165 в наличии
2A930 5 mg $640 в наличии
4A930 25 mg $1640 в наличии
5A930 50 mg $2090 в наличии
6A930 100 mg $2840 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 594 азид

Азидное производное водорастворимого красного флуоресцентного красителя ATT 594 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1B930 1 mg $165 в наличии
2B930 5 mg $640 в наличии
4B930 25 mg $1640 в наличии
5B930 50 mg $2090 в наличии
6B930 100 mg $2840 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

ATT 633 азид

Азидное производное водорастворимого дальнего красного флуоресцентного красителя ATT 633 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1D930 1 mg $110 в наличии
2D930 5 mg $540 в наличии
4D930 25 mg $1640 21 д
5D930 50 mg $2090 21 д
6D930 100 mg $2840 21 д
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 558/568 азид

BDP 558/568 - бордипиррометеновый флуорофор со спектрами поглощения и эмиссии, примерно соответствующими каналу Cyanine3. Это азидопроизводное для клик-реакций.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
17430 1 mg $125 в наличии
27430 5 mg $260 в наличии
37430 10 mg $325 в наличии
47430 25 mg $510 в наличии
57430 50 mg $895 в наличии
67430 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 558/568 алкин

BDP 558/568 - бордипиррометеновый краситель для канала Cyanine3. Данное производное - терминальный алкин красителя для катализируемой медью клик-реакции.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A74B0 1 mg $125 в наличии
B74B0 5 mg $260 в наличии
C74B0 10 mg $325 в наличии
D74B0 25 mg $510 в наличии
E74B0 50 mg $895 в наличии
F74B0 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 576/589 азид

Азидопроизводное красителя BDP 576/589 для мечения алкин-содержащих биомолекул с помощью реакций клик-химии.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
AG430 1 mg $140 в наличии
BG430 5 mg $450 в наличии
DG430 25 mg $1460 в наличии
EG430 50 mg $1890 в наличии
FG430 100 mg $2640 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 581/591 азид

BDP 581/591 - относительно гидрофобный бордипиррометеновый флуорофор, который можно использовать для мониторинга активных форм кислорода (ROS), а также в качестве трейсера в поляризационно-флуоресцентном анализе. Этот краситель - азид для клик-реакций.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
16430 1 mg $125 в наличии
26430 5 mg $260 в наличии
36430 10 mg $325 в наличии
46430 25 mg $510 в наличии
56430 50 mg $895 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 581/591 алкин

BDP 581/591 - бордипиррометеновый флуорофор, особенно хорошо подходящий для изучения анизотропии, микроскопии и двухфотонных экспериментов. Это производное - алкин для медь-катализируемой реакции диполярного циклоприсоединения к азидам.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A64B0 1 mg $125 в наличии
B64B0 5 mg $260 в наличии
C64B0 10 mg $325 в наличии
D64B0 25 mg $510 в наличии
E64B0 50 mg $895 в наличии
F64B0 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 630/650 азид

BDP 630/650 - яркий и фотостабильный бордипиррометеновый краситель для дальнего красного диапазона. Он обладает высокими коэффициентом экстинкции и квантовым выходом флуоресценции. Это производное - азид для клик-химии.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
15430 1 mg $125 в наличии
25430 5 mg $260 в наличии
35430 10 mg $325 в наличии
45430 25 mg $510 в наличии
55430 50 mg $895 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 630/650 алкин

Алкинилированный краситель для катализируемых солями меди реакций клик-химии. Содержит флуорофор BDP 630/650 на основе бордипиррометена для красного канала.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A54B0 1 mg $125 в наличии
B54B0 5 mg $260 в наличии
C54B0 10 mg $325 в наличии
D54B0 25 mg $510 в наличии
E54B0 50 mg $895 в наличии
F54B0 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 650/665 азид

BDP 650/665 - краситель на основе бордипиррометена с эмиссией в красной области. Это азидное производное можно конъюгировать с алкинами в присутствии катализатора - соединений меди (I) или с циклоалкинами без катализатора.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
18430 1 mg $125 в наличии
28430 5 mg $260 в наличии
38430 10 mg $325 в наличии
48430 25 mg $510 в наличии
58430 50 mg $895 в наличии
68430 100 mg по запросу в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® 650/665 алкин

BDP 650/665 - яркий бордипиррометеновый красный флуоресцентный краситель. Терминальную этинильную группу BDP 650/665 алкина можно конъюгировать с различными азидами с помощью медь-катализируемой клик-реакции.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A84B0 1 mg $125 в наличии
B84B0 5 mg $260 в наличии
C84B0 10 mg $325 в наличии
D84B0 25 mg $510 в наличии
E84B0 50 mg $895 в наличии
F84B0 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® FL азид

Азидопроизводное яркого и фотостабильного флуоресцентного бордипиррометенового красителя для флуоресцеинового канала.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
11430 1 mg $125 в наличии
21430 5 mg $260 в наличии
31430 10 mg $325 в наличии
41430 25 mg $510 в наличии
51430 50 mg $895 в наличии
61430 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® FL алкин

Алкиновое производное яркого и фотостабильного бордипиррометенового красителя для флуоресцеинового канала.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A14B0 1 mg $125 в наличии
B14B0 5 mg $260 в наличии
C14B0 10 mg $325 в наличии
D14B0 25 mg $510 в наличии
E14B0 50 mg $895 в наличии
F14B0 100 mg $1490 в наличии
Нашли более выгодное предложение? Сообщите нам и мы предложим выгодные варианты!

BDP® R6G азид

BDP R6G - бордипиррометеновый флуорофор с длинами волн возбуждения и эмиссии, "настроенными" на канал родаминового красителя R6G.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1476-1mg 1 mg $125 в наличии
1476-5mg