Конъюгация белков, модифицированных алкином или азидом, с азидами или алкинами красителей
Каталитический буфер для мечения белков предназначен для проведения реакции CuAAC c белками и оптимизирован для предотвращения повреждения биомолекул активными формами кислорода. Для реакции подходят белки, содержащие алкиновую или азидную группы, а также клетки или компоненты клеточных лизатов, метаболически меченые азидогруппами.
Реакция конъюгации происходит между азидом и терминальной группой алкина и приводит к образованию пятичленного гетероцикла — 1,2,3-триазола. Поскольку обе группы (азида и алкина) практически не встречаются в природных биомолекулах, реакция является высокоспецифичной и эффективной для решения широкого спектра задач.
Реакция протекает в присутствии соединений меди (I); она почти не зависит от pH. Каталитический буфер специально оптимизирован для работы с белками и содержит соль меди (II) — стабильный предшественник каталитически активных соединений меди (I), ацетат триэтиламмония pH 6.8, водорастворимый лиганд THPTA и аминогуанидин. Для восстановления меди (II) рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты. THPTA лиганд в составе буфера ускоряет реакцию и стабилизирует каталитически активные соединения меди (I). Кроме того, присутствие водорастворимого THPTA лиганда позволяет проводить реакцию мечения белков в водной среде (без добавления органических растворителей) и, за счёт стабилизации степени окисления (I) меди, минимизирует генерацию активных форм кислорода (АФК) и нежелательное повреждения ими белков путем окисления гистидина, метионина и цистеина. Входящий в состав буфера аминогуанидин препятствует связыванию реакционноспособных альдегидов — продуктов гидролиза дегидроаскорбата, с боковыми цепями аргинина, N-концевого цистеина и лизина.
Для проведения реакции понадобятся: модифицированный алкином или азидом белок в буфере без азида натрия, азидное или алкиновое производное красителя, 1.5х каталитический буфер, аскорбиновая кислота. Шаги 6–9 рекомендуется выполнять в атмосфере инертного газа — азота или аргона.
Протокол
Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации модифицированных белков с производными красителей:
- Определите общий объем реакции исходя из используемого количества модифицированного
белка:
! Объем раствора белка, модифицированного алкином или азидом, должен составлять не более 1/3 общего
объема реакции.
Общий объём реакции, мкл Количество белка 100 от 4 до 20 нмоль 200 от 20 до 40 нмоль 400 от 40 до 80 нмоль 600 от 80 до 600 нмоль -
Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:
Реагент Объем, мкл Концентрация стокового раствора Азид или алкин красителя (количество белка [нмоль]) × 0.3* 10 мМ в ДМСО или воде Каталитический буфер для мечения белков (общий объем реакции [мкл]) × 0.67 1.5х Активатор
(аскорбиновая кислота)(общий объем реакции [мкл]) × 0.02 50 мМ в воде Вода (общий объем реакции [мкл] - объем раствора красителя [мкл] - объём каталитического буфера [мкл] - объём раствора активатора [мкл]) — - Приготовьте стоковый раствор азида или алкина красителя (10 мМ в ДМСО или воде, для водорастворимых алкинов и азидов) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде). Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
- Добавьте каталитический буфер для мечения белков к раствору модифицированного белка и размешайте на вортексе.
- Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида или алкина красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
- (рекомендуется) Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 с. Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать центрифужный концентратор. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 с включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
- Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройте ее.
- Размешайте раствор на вортексе.
- Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
- Для выделения конъюгата белка с красителем используйте диализ или гель-фильтрацию.
Похожие товары
1-Этинилпирен
Алкинильное производное пирена, флуоресцентного полициклического углеводорода, для клик-химии и реакции Соногаширы.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
515B0 | 50 mg | $50 | в наличии | |
615B0 | 100 mg | $64 | в наличии |
3-Этинилперилен
Этинилперилен - производное полициклического ароматического углеводорода, обладающего интенсивной флуоресценцией с квантовым выходом около 100%.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
555B0 | 50 mg | $100 | в наличии | |
655B0 | 100 mg | $160 | в наличии |
AF 343 (Кумарин)-X-азид
AF 343 (Кумарин) - флуорофор, обладающий эмиссией в синей области спектра. Этот краситель может выступать в роли донора энергии для флуоресцеина. Данное азидное производное можно конъюгировать посредством клик-реакций. Удлиненный линкер обеспечивает пространственное разделение флуорофора и функциональной группы и улучшает растворимость реагента.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
12630 | 1 mg | $105 | в наличии | |
22630 | 5 mg | $165 | в наличии | |
42630 | 25 mg | $285 | в наличии | |
52630 | 50 mg |
$495
|
в наличии | |
62630 | 100 mg |
$880
|
в наличии |
AF 384 (PEP, фенилэтинилпирен) азид
Флуорофор на основе полициклических ароматических углеводородов, флуоресцирующий в синей области. Хорошая альтернатива AMCA и другим кумариновым красителям.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A4530 | 1 mg | $110 | в наличии | |
B4530 | 5 mg | $210 | в наличии | |
C4530 | 10 mg | $310 | в наличии | |
D4530 | 25 mg |
$410
|
в наличии | |
E4530 | 50 mg |
$695
|
в наличии |
AF 430 азид
Азидопроизводное красителя AF 430 для мечения алкин-содержащих биомолекул с помощью реакций клик-химии.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A0830 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B0830 | 5 mg | $325 | в наличии | |
D0830 | 25 mg |
$950
|
в наличии | |
E0830 | 50 mg |
$1625
|
в наличии | |
F0830 | 100 mg |
$2090
|
в наличии |
AF 430 алкин
Алкиновое производное красителя AF 430 с эмиссией в желто-зеленой области спектра для для медь-катализируемой клик-реакции с азидами.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A08B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B08B0 | 5 mg | $325 | в наличии | |
C08B0 | 10 mg |
$480
|
в наличии | |
D08B0 | 25 mg |
$950
|
в наличии | |
E08B0 | 50 mg |
$1625
|
в наличии | |
F08B0 | 100 mg |
$2090
|
в наличии |
AF 488 азид
Азид флуорофора AF 488, с эмиссией в зеленой области спектра. Реагирует с алкинами в медь-катализируемых реакциях циклоприсоединения.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
S1830 | 250 ug | – | в наличии | |
11830 | 1 mg | $125 | в наличии | |
21830 | 5 mg | $325 | в наличии | |
41830 | 25 mg |
$950
|
в наличии | |
51830 | 50 mg |
$1625
|
в наличии | |
61830 | 100 mg |
$2090
|
в наличии |
AF 488 алкин
Алкиновое производное красителя AF 488 для медь-катализируемой реакции циклоприсоединения к азидам. Чистый 5-изомер.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
S18B0 | 250 ug | – | 20 д | |
A18B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B18B0 | 5 mg | $325 | в наличии | |
D18B0 | 25 mg |
$950
|
в наличии | |
E18B0 | 50 mg |
$1625
|
в наличии | |
F18B0 | 100 mg |
$2090
|
в наличии |
AF 555 азид
Азидопроизводное флуоресцентного красителя AF 555 для конъюгации с помощью клик-химии.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
SK830 | 250 ug | – | в наличии | |
1K830 | 1 mg | $140 | в наличии | |
2K830 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
4K830 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
5K830 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
6K830 | 100 mg |
$2640
|
в наличии |
AF 568 азид
Азидопроизводное красителя AF 568 для флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A5820 | 1 mg | $140 | в наличии | |
B5820 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
C5820 | 10 mg |
$585
|
в наличии | |
D5820 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
E5820 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
F5820 | 100 mg |
$2990
|
в наличии |
AF 568 алкин
Производное AF 568 для флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметре. Чистый 5-изомер.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A48B0 | 1 mg | $140 | в наличии | |
B48B0 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
C48B0 | 10 mg |
$585
|
в наличии | |
D48B0 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
E48B0 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
F48B0 | 100 mg |
$2990
|
в наличии |
AF 594 азид
Азидное производное водорастворимого красного флуоресцентного красителя AF 594 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
S7830 | 250 ug | – | в наличии | |
A7830 | 1 mg | $140 | в наличии | |
B7830 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
D7830 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
E7830 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
F7830 | 100 mg |
$2640
|
в наличии |
AF 647 азид
Азидопроизводное красителя AF 647 для мечения алкин-содержащих молекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
S6830 | 250 ug | – | в наличии | |
A6830 | 1 mg | $140 | в наличии | |
B6830 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
D6830 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
E6830 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
F6830 | 100 mg |
$2640
|
в наличии |
AMCA азид
Азидопроизводное флуоресцентного красителя AMCA для конъюгации с помощью клик-химии. AMCA — один из самых ярких синих флуоресцентных красителей с большим сдвигом Стокса и высокой устойчивостью к фотовыгоранию.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
3605-1mg | 1 mg | $60 | в наличии | |
3605-5mg | 5 mg | $110 | в наличии | |
3605-25mg | 25 mg |
$540
|
в наличии | |
3605-50mg | 50 mg |
$885
|
в наличии | |
3605-100mg | 100 mg |
$1050
|
в наличии |
ATT 550 азид
Азидное производное водорастворимого желтого флуоресцентного красителя ATT 550 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
1C930 | 1 mg | $165 | в наличии | |
2C930 | 5 mg |
$640
|
в наличии | |
4C930 | 25 mg |
$1640
|
в наличии | |
5C930 | 50 mg |
$2090
|
в наличии | |
6C930 | 100 mg |
$2840
|
в наличии |
ATT 565 азид
Азидное производное водорастворимого оранжевого флуоресцентного красителя ATT 565 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов. Чистый 6-изомер.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
1A930 | 1 mg | $165 | в наличии | |
2A930 | 5 mg |
$640
|
в наличии | |
4A930 | 25 mg |
$1640
|
в наличии | |
5A930 | 50 mg |
$2090
|
в наличии | |
6A930 | 100 mg |
$2840
|
в наличии |
ATT 594 азид
Азидное производное водорастворимого красного флуоресцентного красителя ATT 594 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
1B930 | 1 mg | $165 | в наличии | |
2B930 | 5 mg |
$640
|
в наличии | |
4B930 | 25 mg |
$1640
|
в наличии | |
5B930 | 50 mg |
$2090
|
в наличии | |
6B930 | 100 mg |
$2840
|
в наличии |
ATT 633 азид
Азидное производное водорастворимого дальнего красного флуоресцентного красителя ATT 633 для мечения алкинсодержащих биомолекул и флуоресцентной визуализации биологических объектов.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
1D930 | 1 mg | $110 | в наличии | |
2D930 | 5 mg |
$540
|
в наличии | |
4D930 | 25 mg |
$1640
|
21 д | |
5D930 | 50 mg |
$2090
|
21 д | |
6D930 | 100 mg |
$2840
|
21 д |
BDP® 558/568 азид
BDP 558/568 - бордипиррометеновый флуорофор со спектрами поглощения и эмиссии, примерно соответствующими каналу Cyanine3. Это азидопроизводное для клик-реакций.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
17430 | 1 mg | $125 | в наличии | |
27430 | 5 mg | $260 | в наличии | |
37430 | 10 mg | $325 | в наличии | |
47430 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
57430 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
67430 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® 558/568 алкин
BDP 558/568 - бордипиррометеновый краситель для канала Cyanine3. Данное производное - терминальный алкин красителя для катализируемой медью клик-реакции.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A74B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B74B0 | 5 mg | $260 | в наличии | |
C74B0 | 10 mg | $325 | в наличии | |
D74B0 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
E74B0 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
F74B0 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® 576/589 азид
Азидопроизводное красителя BDP 576/589 для мечения алкин-содержащих биомолекул с помощью реакций клик-химии.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
AG430 | 1 mg | $140 | в наличии | |
BG430 | 5 mg |
$450
|
в наличии | |
DG430 | 25 mg |
$1460
|
в наличии | |
EG430 | 50 mg |
$1890
|
в наличии | |
FG430 | 100 mg |
$2640
|
в наличии |
BDP® 581/591 азид
BDP 581/591 - относительно гидрофобный бордипиррометеновый флуорофор, который можно использовать для мониторинга активных форм кислорода (ROS), а также в качестве трейсера в поляризационно-флуоресцентном анализе. Этот краситель - азид для клик-реакций.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
16430 | 1 mg | $125 | в наличии | |
26430 | 5 mg | $260 | в наличии | |
36430 | 10 mg | $325 | в наличии | |
46430 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
56430 | 50 mg |
$895
|
в наличии |
BDP® 581/591 алкин
BDP 581/591 - бордипиррометеновый флуорофор, особенно хорошо подходящий для изучения анизотропии, микроскопии и двухфотонных экспериментов. Это производное - алкин для медь-катализируемой реакции диполярного циклоприсоединения к азидам.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A64B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B64B0 | 5 mg | $260 | в наличии | |
C64B0 | 10 mg | $325 | в наличии | |
D64B0 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
E64B0 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
F64B0 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® 630/650 азид
BDP 630/650 - яркий и фотостабильный бордипиррометеновый краситель для дальнего красного диапазона. Он обладает высокими коэффициентом экстинкции и квантовым выходом флуоресценции. Это производное - азид для клик-химии.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
15430 | 1 mg | $125 | в наличии | |
25430 | 5 mg | $260 | в наличии | |
35430 | 10 mg | $325 | в наличии | |
45430 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
55430 | 50 mg |
$895
|
в наличии |
BDP® 630/650 алкин
Алкинилированный краситель для катализируемых солями меди реакций клик-химии. Содержит флуорофор BDP 630/650 на основе бордипиррометена для красного канала.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A54B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B54B0 | 5 mg | $260 | в наличии | |
C54B0 | 10 mg | $325 | в наличии | |
D54B0 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
E54B0 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
F54B0 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® 650/665 азид
BDP 650/665 - краситель на основе бордипиррометена с эмиссией в красной области. Это азидное производное можно конъюгировать с алкинами в присутствии катализатора - соединений меди (I) или с циклоалкинами без катализатора.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
18430 | 1 mg | $125 | в наличии | |
28430 | 5 mg | $260 | в наличии | |
38430 | 10 mg | $325 | в наличии | |
48430 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
58430 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
68430 | 100 mg | по запросу | в наличии |
BDP® 650/665 алкин
BDP 650/665 - яркий бордипиррометеновый красный флуоресцентный краситель. Терминальную этинильную группу BDP 650/665 алкина можно конъюгировать с различными азидами с помощью медь-катализируемой клик-реакции.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A84B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B84B0 | 5 mg | $260 | в наличии | |
C84B0 | 10 mg | $325 | в наличии | |
D84B0 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
E84B0 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
F84B0 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® FL азид
Азидопроизводное яркого и фотостабильного флуоресцентного бордипиррометенового красителя для флуоресцеинового канала.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
11430 | 1 mg | $125 | в наличии | |
21430 | 5 mg | $260 | в наличии | |
31430 | 10 mg | $325 | в наличии | |
41430 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
51430 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
61430 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® FL алкин
Алкиновое производное яркого и фотостабильного бордипиррометенового красителя для флуоресцеинового канала.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
A14B0 | 1 mg | $125 | в наличии | |
B14B0 | 5 mg | $260 | в наличии | |
C14B0 | 10 mg | $325 | в наличии | |
D14B0 | 25 mg |
$510
|
в наличии | |
E14B0 | 50 mg |
$895
|
в наличии | |
F14B0 | 100 mg |
$1490
|
в наличии |
BDP® R6G азид
BDP R6G - бордипиррометеновый флуорофор с длинами волн возбуждения и эмиссии, "настроенными" на канал родаминового красителя R6G.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
1476-1mg | 1 mg | $125 | в наличии | |
1476-5mg |