Протокол конъюгации белков, модифицированных алкином или азидом с азидами или алкинами красителей

Каталитический буфер для мечения белков предназначен для проведения реакции CuAAC c белками и оптимизирован для предотвращения повреждения биомолекул активными формами кислорода. Для реакции подходят белки, содержащие алкиновую или азидную группы, а также клетки или компоненты клеточных лизатов, метаболически меченые азидогруппами.

Реакция конъюгации происходит между азидом и терминальной группой алкина и приводит к образованию пятичленного гетероцикла — 1,2,3-триазола. Поскольку обе группы (азида и алкина) практически не встречаются в природных биомолекулах, реакция является высокоспецифичной и эффективной для решения широкого спектра задач.

Scheme of copper catalyzed Click chemistry alkyne azide cycloaddition

Реакция протекает в присутствии соединений меди (I); она почти не зависит от pH. Каталитический буфер специально оптимизирован для работы с белками и содержит соль меди (II) — стабильный предшественник каталитически активных соединений меди (I), ацетат триэтиламмония pH 6.8, водорастворимый лиганд THPTA и аминогуанидин. Для восстановления меди (II) рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты. THPTA лиганд в составе буфера ускоряет реакцию и стабилизирует каталитически активные соединения меди (I). Кроме того, присутствие водорастворимого THPTA лиганда позволяет проводить реакцию мечения белков в водной среде (без добавления органических растворителей) и, за счёт стабилизации степени окисления (I) меди, минимизирует генерацию активных форм кислорода (АФК) и нежелательное повреждения ими белков путем окисления гистидина, метионина и цистеина. Входящий в состав буфера аминогуанидин препятствует связыванию реакционноспособных альдегидов — продуктов гидролиза дегидроаскорбата, с боковыми цепями аргинина, N-концевого цистеина и лизина.

Для проведения реакции понадобятся: модифицированный алкином или азидом белок в буфере без азида натрия, азидное или алкиновое производное красителя, 1.5х каталитический буфер, аскорбиновая кислота. Шаги 6–9 рекомендуется выполнять в атмосфере инертного газа — азота или аргона.

Протокол

Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации модифицированных белков с производными красителей:

  1. Определите общий объем реакции исходя из используемого количества модифицированного белка:
    ! Объем раствора белка, модифицированного алкином или азидом, должен составлять не более 1/3 общего объема реакции.
    Общий объём реакции, мкл Количество белка
    100 от 4 до 20 нмоль
    200 от 20 до 40 нмоль
    400 от 40 до 80 нмоль
    600 от 80 до 600 нмоль
  2. Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:
    Реагент Объем, мкл Концентрация стокового раствора
    Азид или алкин красителя (количество белка [нмоль]) × 0.3* 10 мМ в ДМСО или воде
    Каталитический буфер для мечения белков (общий объем реакции [мкл]) × 0.67 1.5х
    Активатор
    (аскорбиновая кислота)
    (общий объем реакции [мкл]) × 0.02 50 мМ в воде
    Вода (общий объем реакции [мкл] - объем раствора красителя [мкл] - объём каталитического буфера [мкл] - объём раствора активатора [мкл]) — 
    * - избыток красителя может варьироваться в зависимости от количества азидных или алкиновых групп на молекуле белка. Расчёт в таблице приведен для избытка красителя 3х. Для избытка красителя 1.5–10х необходимо умножить количество белка (нмоль) на 0.15–1. Однако помните, что если используется нерастворимый в воде азид или алкин, большой его избыток может выпасть в осадок из реакционной смеси. Пользуйтесь водорастворимыми красителями, например сульфированными цианиновыми красителями sulfo-Cyanine.
  3. Приготовьте стоковый раствор азида или алкина красителя (10 мМ в ДМСО или воде, для водорастворимых алкинов и азидов) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде).
    Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
  4. Добавьте каталитический буфер для мечения белков к раствору модифицированного белка и размешайте на вортексе.
  5. Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида или алкина красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
  6. (рекомендуется) Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 с.
    Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать центрифужный концентратор. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 с включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
  7. Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройте ее.
  8. Размешайте раствор на вортексе.
  9. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
  10. Для выделения конъюгата белка с красителем используйте диализ или гель-фильтрацию.

Related products

BDP 558/568 ДБЦО

BDP 558/568 ДБЦО - яркий и фотостабильный краситель с эмиссией в желтой области спектра. Он содержит циклооктиновый заместитель (ДБЦО), который способен реагировать с различными азидами в реакциях Click Chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
174F0 1 mg $110.00 в наличии
274F0 5 mg $210.00 в наличии
374F0 10 mg $310.00 в наличии
474F0 25 mg $410.00 в наличии
574F0 50 mg $695.00 в наличии
674F0 100 mg $1190.00 в наличии

BDP 558/568 тетразин

Стабильный флуорофор, который может быть коньюгирован с транс-циклооктеновыми производными биомолекул для их визуализации.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A74E0 1 mg $110.00 в наличии
B74E0 5 mg $210.00 в наличии
C74E0 10 mg $310.00 в наличии
D74E0 25 mg $410.00 в наличии
E74E0 50 mg $695.00 в наличии
F74E0 100 mg $1190.00 в наличии

BDP 650/665 ДБЦО

Краситель с максимумом флуоресценции в красной области спектра, содержит заместитель для безмедной реакции Click Chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
AE4F0 1 mg $110.00 в наличии
BE4F0 5 mg $210.00 в наличии
CE4F0 10 mg $310.00 в наличии
DE4F0 25 mg $410.00 в наличии
EE4F0 50 mg $695.00 в наличии
FE4F0 100 mg $1190.00 в наличии

BDP TMR ДБЦО

Бордипиррометеновый краситель с максимумом флуоресценции в желто-оранжевой области, содержащий ДБЦО-заместитель для участия в реакциях Click Chemistry.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
124F0 1 mg $110.00 в наличии
224F0 5 mg $210.00 в наличии
424F0 25 mg $410.00 в наличии
524F0 50 mg $695.00 в наличии
624F0 100 mg $1190.00 в наличии

BDP TR ДБЦО

Краситель с дибенцоциклооктиновым заместителем для канала ROX.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
1D4F0 1 mg $110.00 в наличии
2D4F0 5 mg $210.00 в наличии
4D4F0 25 mg $410.00 в наличии
5D4F0 50 mg $695.00 в наличии
6D4F0 100 mg $1190.00 в наличии

Cyanine3.5 ДБЦО

Циклооктиновое производное красителя Cyanine3.5, легко реагирующее с различными азидами с образованием стабильных конъюгатов.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
A20F0 1 mg $110.00 в наличии
B20F0 5 mg $210.00 в наличии
C20F0 10 mg $310.00 в наличии
D20F0 25 mg $410.00 в наличии
E20F0 50 mg $695.00 в наличии
F20F0 100 mg $1190.00 в наличии

Каталитический буфер для мечения белков (с THPTA), 1.5х

Каталитический буфер для Click chemistry, содержит THPTA, подходит для модификации белков.
Показать цены
Артикул Фасовка Цена Срок поставки
B5150 1 mL $30.00 в наличии
K5150 10 mL $120.00 в наличии
S5150 50 mL $490.00 в наличии

Товар добавлен. Просмотрите корзину покупок или оформите заказ
Введено некорректное число товаров для добавления.