Конъюгация белков, модифицированных алкином или азидом, с азидами или алкинами красителей
Каталитический буфер для мечения белков предназначен для проведения реакции CuAAC c белками и оптимизирован для предотвращения повреждения биомолекул активными формами кислорода. Для реакции подходят белки, содержащие алкиновую или азидную группы, а также клетки или компоненты клеточных лизатов, метаболически меченые азидогруппами.
Реакция конъюгации происходит между азидом и терминальной группой алкина и приводит к образованию пятичленного гетероцикла — 1,2,3-триазола. Поскольку обе группы (азида и алкина) практически не встречаются в природных биомолекулах, реакция является высокоспецифичной и эффективной для решения широкого спектра задач.
Реакция протекает в присутствии соединений меди (I); она почти не зависит от pH. Каталитический буфер специально оптимизирован для работы с белками и содержит соль меди (II) — стабильный предшественник каталитически активных соединений меди (I), ацетат триэтиламмония pH 6.8, водорастворимый лиганд THPTA и аминогуанидин. Для восстановления меди (II) рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты. THPTA лиганд в составе буфера ускоряет реакцию и стабилизирует каталитически активные соединения меди (I). Кроме того, присутствие водорастворимого THPTA лиганда позволяет проводить реакцию мечения белков в водной среде (без добавления органических растворителей) и, за счёт стабилизации степени окисления (I) меди, минимизирует генерацию активных форм кислорода (АФК) и нежелательное повреждения ими белков путем окисления гистидина, метионина и цистеина. Входящий в состав буфера аминогуанидин препятствует связыванию реакционноспособных альдегидов — продуктов гидролиза дегидроаскорбата, с боковыми цепями аргинина, N-концевого цистеина и лизина.
Для проведения реакции понадобятся: модифицированный алкином или азидом белок в буфере без азида натрия, азидное или алкиновое производное красителя, 1.5х каталитический буфер, аскорбиновая кислота. Шаги 6–9 рекомендуется выполнять в атмосфере инертного газа — азота или аргона.
Протокол
Мы рекомендуем следующий протокол для реакции конъюгации модифицированных белков с производными красителей:
- Определите общий объем реакции исходя из используемого количества модифицированного
белка:
! Объем раствора белка, модифицированного алкином или азидом, должен составлять не более 1/3 общего
объема реакции.
Общий объём реакции, мкл Количество белка 100 от 4 до 20 нмоль 200 от 20 до 40 нмоль 400 от 40 до 80 нмоль 600 от 80 до 600 нмоль -
Рассчитайте объемы реагентов для реакции мечения, используя следующую таблицу:
Реагент Объем, мкл Концентрация стокового раствора Азид или алкин красителя (количество белка [нмоль]) × 0.3* 10 мМ в ДМСО или воде Каталитический буфер для мечения белков (общий объем реакции [мкл]) × 0.67 1.5х Активатор
(аскорбиновая кислота)(общий объем реакции [мкл]) × 0.02 50 мМ в воде Вода (общий объем реакции [мкл] - объем раствора красителя [мкл] - объём каталитического буфера [мкл] - объём раствора активатора [мкл]) — - Приготовьте стоковый раствор азида или алкина красителя (10 мМ в ДМСО или воде, для водорастворимых алкинов и азидов) и активатора (аскорбиновой кислоты, 50 мМ в воде). Обратите внимание, аскорбиновая кислота легко окисляется на воздухе. Используйте только свежеприготовленный раствор активатора (раствор стабилен в течение суток). Для приготовления стокового раствора растворите 10 мг аскорбиновой кислоты в 1.1 мл воды.
- Добавьте каталитический буфер для мечения белков к раствору модифицированного белка и размешайте на вортексе.
- Добавьте рассчитанный объем стокового раствора азида или алкина красителя и еще раз хорошо размешайте на вортексе.
- (рекомендуется) Дегазируйте смесь для удаления кислорода. Для этого присоедините одноразовый наконечник от автоматической пипетки к пластиковой или силиконовой трубке, подсоединенной к редуктору баллона с инертным газом (аргоном, азотом). Включите очень слабый поток газа и опустите наконечник в пробирку так, чтобы он находился на 3–10 мм выше уровня жидкости и не касался жидкости и стенок пробирки. Поток газа должен быть таким, чтобы образовывать воронку в жидкости, но не вызывать ее разбрызгивания. Удерживайте наконечник в таком положении в течение 10–20 с. Если параллельно происходит постановка нескольких реакций мечения, для дегазирования можно использовать центрифужный концентратор. Для этого установите пробирки в прибор, включите вращение, затем на 30–40 с включите вакуум и сбросьте его, подавая на вход прибора инертный газ.
- Добавьте раствор активатора (аскорбиновой кислоты), затем в течение нескольких секунд продуйте пробирку инертным газом и закройте ее.
- Размешайте раствор на вортексе.
- Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 8–16 часов.
- Для выделения конъюгата белка с красителем используйте диализ или гель-фильтрацию.
Похожие товары
AF 488 азид
Азид флуорофора AF 488, с эмиссией в зеленой области спектра. Реагирует с алкинами в медь-катализируемых реакциях циклоприсоединения.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
S1830 | 250 ug | – | в наличии | |
11830 | 1 mg | $125 | в наличии | |
21830 | 5 mg | $325 | в наличии | |
41830 | 25 mg | $950 | в наличии | |
51830 | 50 mg | $1625 | в наличии | |
61830 | 100 mg | $2090 | в наличии |
Cu(II)-THPTA каталитический буфер, 1.5x
Готовый каталитический буфер для клик-химии, содержащий медь(II) и водорастворимый лиганд THPTA. Буфер подходит для модификации пептидов и белков.Артикул | Фасовка | Цена | Срок поставки | Купить товар |
---|---|---|---|---|
B5150 | 1 mL | $30 | в наличии | |
K5150 | 10 mL | $120 | в наличии | |
S5150 | 50 mL | $490 | в наличии |